SEBBM nº 225

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En el artículo «Cinética hiperbólica y cinética sigmoide: la forma de la curva importa, ¡y mucho!», de la Revista SEBBM  nº 223, los doctores Vicente Rubio, Félix M. Goñi y Carlos Gancedo lamentaban la escasa relevancia que se da a la cinética enzimática en los textos de bioquímica y, en contraposición a la avalancha de resultados que generan las nuevas tecnologías, rememoraban algunas aportaciones de la cinética al estudio de la enfermedad. El presente comentario pretende aportar razones adicionales que respaldan la importancia de la cinética enzimática en las ciencias biológicas.

Los autores describían un «enzimokit» de ayuda que incluye las dos modalidades de cinética enzimática: sigmoide e hiperbólica. La primera fue descrita en 1904 por el fisiólogo danés Christian Bohr, quien observó que la presencia de anhídrido carbónico o un aumento de la acidez del medio afectaban a la unión del oxígeno a la hemoglobina. La representación de la proporción de oxígeno unido a la hemoglobina en función de la presión parcial de oxígeno genera una curva sigmoide que se asocia a un mecanismo regulador fisiológico denominado efecto Bohr. Esto, a modo de un Pisuerga, trae a colación una curiosa anécdota acontecida a su hijo Niels, futuro premio Nobel de Física. En 1943, Niels Bohr volaba desde Suecia, que era neutral, a Inglaterra para visitar a Winston Churchill. Al sobrevolar Noruega, ocupada por los alemanes, el avión aumentó su altitud y el piloto advirtió a los pasajeros que se pusieran las mascarillas de oxígeno. Bohr, que tenía un cráneo de considerable tamaño, no llevaba puesto el casco intercomunicador y no oyó la advertencia del piloto, por lo que entró en hipoxia al disminuir la presión del oxígeno y perdió el conocimiento. Al llegar al mar del Norte, el avión descendió y Bohr recuperó la consciencia. Es muy probable que, para proteger el cerebro, el organismo activara una serie de respuestas fisiológicas, incluyendo el efecto descrito por su padre, lo que le permitió participar posteriormente en el proyecto Manhattan [1].

La cinética sigmoide es propia de las enzimas «alostéricas», cuya forma y actividad se modifican tras la unión de un ligando y desempeñan un papel clave en la regulación metabólica. Por su parte, la cinética hiperbólica se remonta a los trabajos de A. J. Brown, Victor Henri y Michaelis y Menten. En este enfoque, el gráfico que representa la velocidad de reacción en función de la concentración del sustrato es una curva hiperbólica que se convierte en una recta mediante las transformaciones de Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf y Eadie-Hofstee.

Nuestro laboratorio posee una larga experiencia en el estudio de los anticuerpos monoclonales y, partiendo de la similitud entre la reacción entre un anticuerpo monoclonal (mAb) y su antígeno con la de la enzima y su sustrato, hemos aplicado métodos cinéticos basados en un equilibrio rápido para investigar algunos de los parámetros funcionales que definen los mecanismos de reacción de las inmunoglobulinas: la constante cinética de asociación (k₊₁) y la constante termodinámica de disociación del complejo en equilibrio (K_d).

En el presente, los métodos tradicionales para investigar dichas constantes han sido reemplazados, en gran parte, por la técnica de resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés), que genera datos en tiempo real [2]. Sin embargo, la tecnología SPR precisa de un instrumental costoso y no universalmente accesible. Como alternativa, los inmunoensayos enzimáticos (ELISA, por sus siglas en inglés) son métodos sensibles, económicos y pueden adaptarse a distintos formatos de análisis. Además, los resultados obtenidos por ambas técnicas son similares.

Para caracterizar las constantes de asociación y de equilibrio de un anticuerpo monoclonal hemos desarrollado inmunoensayos fundamentados, en gran parte, en métodos enzimáticos. A continuación, y como respaldo a las tesis de los autores del trabajo que comentamos, se describen dos formatos de ELISA dirigidos a determinar las constantes de asociación (k₊₁) y de disociación (K_d) de dos anticuerpos monoclonales.

Conocer la constante de asociación (k₊₁)  de los anticuerpos es importante ya que define la fracción de ligando unido por unidad de tiempo, es decir, la velocidad de la reacción. Además, a esta constante se le asigna un valor pronóstico positivo relacionado con la respuesta inmunitaria. Para determinar la k₊₁ se utilizó el anticuerpo monoclonal SIM 253-19 (IgG_2b) que reconoce la toxina colérica (CT). En el ensayo se mide la cinética de unión de distintas concentraciones de CT conjugada a biotina (CT-b) al mAb fijado a la placa con antiglobulina. La reacción CT-b-mAb es de segundo orden, pero su análisis se simplifica si se lleva a cabo en condiciones de pseudoprimer orden, utilizando una concentración de ligando en suficiente exceso con respecto a la del anticuerpo monoclonal ([CT-b] >> [mAb]). La unión del CT-b al mAb sigue un curso hiperbólico descrito por la ecuación de primer orden P_t = P_m (1 – e ^{– kobs.t}), en la que P_t es el ligando unido en distintos tiempos y P_m la unión limitante. Al ajustar los datos de la unión de CT-b a esta ecuación, se genera una familia de curvas que muestran distintos valores de k_obs (constante de velocidad de primer orden) en función de las concentraciones de CT-b. En condiciones de pseudoprimer orden, la ecuación de la velocidad se reduce a v = k_obs [mAb], donde k_obs = k₊₁ [CT-b]. Finalmente, el valor de k₊₁ se obtiene de la pendiente de la representación de k_obs frente a las concentraciones de CT-b (Figura 1).

Para calcular las constantes de primer (k_obs) y segundo (k₊₁) orden empleamos seis procedimientos que combinan métodos cinéticos y enzimáticos. El proceso más directo para calcular k₊₁ consiste en representar las k_obs obtenidas en la ecuación de primer orden P_t = P_m (1 – e ^{– kobs.t}) frente a [CT-b]. Los procedimientos alternativos utilizados incluyen las siguientes representaciones: ii) de las vidas medias (log_e2/K_m) derivadas de la ecuación de Michaelis-Menten frente a [CT-b]; iii) de V_max/K_m frente a [CT-b], donde V_max/K_m es la pendiente de la curva en la fase inicial de la reacción; iv) de la velocidad inicial (v₀) calculada por el método de Boeker [3] frente a [CT-b], y, también, dos transformaciones lineales v) de tipo Hanes-Woolf y vi) de tipo Lineweaver-Burk. El valor medio de las k₊₁ calculadas con estos seis métodos fue de 1,8 ± 0,11 × 10⁶ M^-1 s^-1, y el resultado del análisis realizado por SPR (Biacore) fue de 1,60 ± 0,17 × 10⁶ M^-1 s^-1 [4]. Ambos procedimientos generan resultados similares.

Se considera que la afinidad es el parámetro que mejor define la actividad de un anticuerpo, ya que denota la fuerza de su interacción con el ligando y la sensibilidad de la reacción. A continuación, se describe un ELISA cinético para determinar la constante de afinidad (K_d) del anticuerpo monoclonal SIM 28 (IgG₁), que reconoce la enzima peroxidasa (HRP)

En este ensayo se mide la unión de la HRP a una serie de diluciones dobles, 1/150, 1/300, 1/600 y 1/1200, de mAb fijado a la placa con antiglobulina. La reacción, en condiciones de [HRP] >> [mAb], se llevó a cabo hasta alcanzar la saturación del anticuerpo (94%). Las curvas de unión de la HRP a las distintas diluciones del anticuerpo se analizaron mediante la ecuación de Michaelis-Menten para obtener los valores de la constante K_t, y la velocidad limitante (V_max). La K_t (K_s con dimensiones de tiempo) se define como el tiempo que tarda la HRP en ocupar el 50% de los parátopos del mAb. El gráfico de unión de la HRP al mAb muestra que el valor de la V_max disminuye al aumentar la dilución del mAb fijado a la placa (menor concentración del mAb), mientras que los valores de K_t apenas se alteran (Figura 2). Al representar los valores de la velocidad frente al tiempo mediante la ecuación de Lineweaver-Burk se observa que las pendientes de las rectas y su intersección con el eje de ordenadas aumentan por un mismo factor, y que las distintas rectas cortan el eje de abscisas en un punto común situado a la izquierda de la ordenada (véase la Figura 3). Esta cinética es propia de un mecanismo de inhibición no competitiva, en el que K_t se define como el tiempo necesario para duplicar la pendiente o reducir a la mitad el valor de V_max en el gráfico. Este mecanismo ofrece un método rápido y directo para calcular la K_i (constante de inhibición sinónima de K_d) del mAb. El procedimiento, que denominamos método 2×K_t, consiste en duplicar los valores de las K_t de las distintas curvas y dividirlos por el tiempo total de la reacción, lo que genera una serie de factores adimensionales que al multiplicarse por la concentración de HRP nos dan la K_i correspondiente a cada dilución del mAb. El valor definitivo de la K_i se obtiene como la media de los valores derivados de las cuatro diluciones. Los valores de afinidad (media  ± intervalo de confianza del 95%) calculados con el Biacore y el método 2×K_t son, respectivamente, 4,3 ± 0.57 × 10^-9 M y 4,6 ± 0,67 × 10^-9 M [5]. 

No es fácil intuir que la cinética de saturación de un mAb se ajuste a un mecanismo de inhibición no competitiva, sobre todo, ¡en ausencia de un componente inhibidor en la reacción! En trabajos previos [6] mostramos que la competición entre un mAb y un antígeno en disolución por la unión al antígeno fijado a la placa sigue un mecanismo de inhibición competitiva lineal (se comprueba con el gráfico ligando/v frente a inhibidor), mientras que la reacción de saturación descrita anteriormente muestra inhibición de tipo no competitivo. De no haberse utilizado métodos de cinética enzimática, no se habría podido identificar este mecanismo inhibitorio, ya que ambos tipos de inhibición son indistinguibles mediante un análisis gráfico tradicional [7].

Esto confirma que la metodología enzimática puede incluso alumbrar mecanismos imprevisibles. Aunque un gráfico quizá no ofrezca al investigador las ventajas de un programa informático, sí proporciona una herramienta alternativa que permite percibir detalles inadvertidos y corregir irregularidades experimentales que, de otra manera, pasarían desapercibidas. No en vano se ha escrito que «no existe ninguna herramienta estadística tan poderosa como un gráfico bien elegido» [8].

Referencias

1. Cooper C. Blood. A very short introduction. Oxford University Press (2016). ISBN: 9780199581450
2. Van Reggenmortel MHV. Antibody reactions with multiepitopic antigens. Chapter 40. En: Handbook of Experimental Immunology 5^th ed., vol.1. Blackwell Scientific, Oxford, UK (1996).
3. Boeker E. Initial rates: A new plot. Biochemical  Journal  203 (1982) 117-123.  doi:10.1042/bj2030117
4. Moreno I, Infantes JA, Domínguez M, Toraño A. Monoclonal antibody on-rate constant determined from time-course data of ligand binding by capture ELISA: Evaluation of eight data analysis methods. Journal of Immunological Methods 506 (2022) 113292.  doi:10.1016/j.jim.2022.113292
5. Toraño A, Moreno I, Infantes JA, Domínguez M. Description of a non-competitive ELISA based on time course analysis of ligand binding at saturation, and a direct method for calculating the affinity of monoclonal antibodies. Journal of Immunological Methods 534 (2024) 113756. doi:10.1016/j.jim.2024.113756
6. Toraño A, Moreno I, Infantes JA, Domínguez M. Development of a competitive inhibition kinetic ELISA to determine the inhibition constant (Ki) of monoclonal antibodies. Journal of Immunological Methods 493 (2021) 113042. doi:10.1016/j.jim.2021.113042
7. Bisswanger H. Enzyme Kinetics: principles and methods, 3^rd ed. Wiley-VCH (2017). ISBN: 9783527806492.
8. Chambers JM, Cleveland WS, Klein B, Tuckey PA. Graphical methods for data analysis. Chapman and Hall/CRC (1983). ISBN: 9781351072304. doi:10.1201/9781351072304