La mayor parte del genoma de los vertebrados está constituido por ADN no codificante, que contiene elementos reguladores en cis (ERCs) responsables de controlar la expresión de sus genes diana mediante la interacción física con sus promotores. En el genoma humano, se ha llegado a estimar que existen más de 6 millones de ERCs putativos, de los cuales decenas de miles están activos en cada tejido o tipo celular, pudiendo localizarse a grandes distancias (hasta 1-2 Mb) de los genes que controlan. La organización 3D de la cromatina es clave para asegurar interacciones específicas entre ERCs y sus genes diana.
La estructura organizada y heterogénea del genoma eucariota empezó a describirse ya a principios del siglo XX, con la observación de dominios de heterocromatina y eucromatina en el núcleo mediante microscopía electrónica. No obstante, la implementación de técnicas de captura de conformación de cromatina, especialmente Hi-C y sus variantes, ha sido fundamental para revelar la compleja y jerárquica organización del genoma y su vínculo con el control de la expresión génica (Figura 1).
La organización jerárquica de la cromatina. (A) Esquema de los distintos niveles de organización de la cromatina, desde los territorios cromosómicos (izquierda) hasta los TADs y bucles de la cromatina (derecha), pasando por los compartimentos. (B) Esquema del modelo de ”loop extrusion” y del complejo Cohesina. Las cabezas de flecha púrpura y rosa indican los sitios de unión de CTCF y su orientación.
Dominios topológicamente asociados: la unidad básica de organización del genoma
Los estudios pioneros de Dixon y col. revelaron que los genomas se organizan en dominios 3D denominados TADs (del inglés Topologicaly Associated Domains): regiones donde las secuencias de ADN interactúan preferentemente entre sí en comparación con secuencias fuera de ellas. Estos dominios, de 0,5-1 Mb en mamíferos, se han propuesto como delimitadores del entorno regulador de los genes gracias a la actividad aisladora de sus bordes. A su vez, la organización interna de los TADs se basa en el establecimiento de bucles de cromatina que corresponden, en gran medida, a interacciones entre elementos reguladores y promotores, y que tienen un tamaño medio de 100-200 kb.
Diferentes estudios apuntan a que los TADs constituyen entidades en gran parte conservadas entre diferentes tipos celulares/tejidos, mientras que los bucles de cromatina muestran una mayor plasticidad entre los mismos. Además, los TADs pueden subdividirse en dominios más pequeños (subTADs) y/o asociarse en dominios jerárquicamente superiores (superTADs, TAD cliques). A escalas más altas, los TADs se asocian dependiendo del estado transcripcional de los genes que contienen, constituyendo compartimentos que varían considerablemente entre diferentes tipos celulares y tejidos. Así, los TADs “activos” conforman los compartimentos de tipo A, que tienden a ubicarse alejados de la membrana nuclear, mientras que los TADs “reprimidos” se organizan en los compartimentos B, a menudo asociados con la lámina nuclear. Finalmente, los cromosomas se organizan en el núcleo interfásico ocupando territorios específicos y reproducibles.
Mecanismos que contribuyen a la organización de los TADs
El establecimiento de los TADs está mediado por un conjunto de proteínas que incluye CTCF (CCCTC binding factor) y el complejo Cohesina. CTCF es un factor de transcripción con dominios de dedo de zinc que reconoce una secuencia consenso de 20 pb. Sus sitios de unión están particularmente enriquecidos en los bordes de los TADs y su número y afinidad por CTCF correlaciona con el aislamiento de dichos límites. Cohesina es un complejo proteico que media la cohesión entre las cromátidas hermanas durante la división celular, pero que también ejerce importantes funciones de regulación transcripcional. En este contexto, Cohesina abraza el ADN y utiliza la hidrolisis del ATP para desplazar la fibra de cromatina. El modelo actual para el establecimiento de los TADs, se conoce como “loop extrusion”, y postula que los complejos Cohesina se cargan aleatoriamente en la cromatina donde extruden bucles de cromatina hasta colisionar con sitios CTCF ocupados por la proteína con su dominio N-terminal enfrentado al sentido de progresión del complejo. Así, los bordes de los TADs muestran a menudo sitios CTCF orientados de forma convergente (Figura 1B).
Dentro de los TADs, la interacción entre promotores y ERCs depende tanto de la actividad extrusiva de Cohesina como de la acción de enlace de diversos factores de transcripción. La primera se basa en que los promotores génicos también están enriquecidos en sitios de unión de CTCF, aunque estos suelen estar en menor número y ser de menor afinidad que los encontrados en los bordes de los TADs. Dichos sitios CTCF actúan como elementos de anclaje promoviendo la interacción con ERC distales donde Cohesina es retenida por complejos transcripcionales, modificadores epigenéticos y enhancer-RNAs/lncRNAs. Entre los elementos de enlace implicados en las interacciones ERCs-promotores cabe destacar YY1, un factor de transcripción con dominios de dedos de zinc que dimeriza promoviendo contactos entre enhancers y promotores activos. Otro actor importante es Mediator, un gran complejo de 26 subunidades que interacciona por una parte con los factores de transcripción unidos a ERCs, y por otra con el complejo de la ARN polimerasa II. De esta forma, Mediator promueve la expresión génica mediante el reclutamiento de diversos ERCs y la formación de grandes agregados proteicos que se segregan espacialmente en hubs transcripcionales mediante un mecanismo de separación de fases.
Implicaciones funcionales de los TADs
Diversos estudios han abordado la cuestión de la relevancia funcional de la organización 3D del genoma en TADs mediante diversas aproximaciones genéticas. Trabajos pioneros a los que contribuyeron diferentes investigadores españoles, como los del laboratorio de José Luis Gomez Skarmeta y de Dario Lupiañez, entre otros, demostraron que los bordes de los TADs permiten aislar la regulación de genes localizados en dominios adyacentes. De hecho, la eliminación de estas regiones, o de sus sitios CTCF, resulta en la pérdida de aislamiento entre TADs y en la ganancia de interacciones ectópicas entre enhancers y promotores. En este contexto, cabe desatacar la implementación de herramientas informáticas, como la desarrollada por el laboratorio de Álvaro Rada Iglesias, capaces de predecir el efecto de dichas variantes en función de la estructura de los TADs y la distribución de ERCs.
Dichas evidencias contrastan con la observación de que la disrupción de CTCF o elementos del complejo Cohesina, a pesar de disrumpir la organización de los TADs solo repercute en efectos modestos en la expresión génica, abriendo un debate sobre la relevancia funcional de la organización en TADs. Una posible explicación es que estos estudios se realizaron en células terminalmente diferenciadas, que no recapitulan la compleja dinámica de expresión génica de los procesos de desarrollo. De hecho, en ensayos de diferenciación celular la depleción de Cohesina resulta en un impacto mayor sobre la expresión de genes dinámicamente regulados durante dichos procesos. También se ha demostrado que enhancers localizados a largas distancia (particularmente enriquecidos en los dominios reguladores de genes de desarrollo), suelen ser mayormente dependientes de la actividad de proteínas arquitecturales para interaccionar con sus promotores diana en comparación con ERC proximales. Otra posibilidad es que CTCF/Cohesina contribuyan al establecimiento de las interacciones enhancer-promotor, pero no serían estrictamente necesarias para su mantenimiento. En este modelo, las modificaciones epigenéticas y la actividad de factores de transcripción serían suficientes para mantener el estado transcripcional de los genes, particularmente en células diferenciadas y no proliferativas.
La relación entre la organización de la cromatina y la transcripción también ha sido intensamente estudiada en el contexto de la activación de la expresión génica en el cigoto (Zigote Genome Activation,ZGA por sus siglas en inglés). Después de la fusión de los gametos, la organización en TADs y compartimentos del genoma cigótico es muy débil y no se afirma hasta el estadio de 4-8 células (en mamíferos) correlacionando con la activación de la transcripción de los genes del cigoto. Sin embargo, hasta qué punto el establecimiento de la organización 3D de la cromatina es necesaria para la ZGA en mamíferos aún no está clara. Una discusión mucho más exhaustiva de estos aspectos puede encontrarse en la revisión de Bondarieva A y Tachibana K (2024).
La organización del genoma en perspectiva Evo-Devo
Los TADs se describieron inicialmente en mamíferos y Drosophila, y posteriormente en todos los linajes eucariotas, e incluso procariotas, analizados hasta la fecha, aún con excepciones. Por ejemplo, los autosomas del nematodo C. elegans se organizan en TADs, pero presentan bajos niveles de interacción intra-dominio y de aislamiento, coincidiendo con la pérdida secundaria de CTCF a lo largo del linaje de nematodos. Así mismo, el urocordado (el grupo hermano de los vertebrados) Ciona intestinalis y el cnidario Nematostella vectensis carecen de TADs, posiblemente por eventos de pérdida secundaria asociados a la divergencia evolutiva de sus genomas.
Ensayos funcionales y la distribución de sitios CTCF sugieren que el modelo de “loop extrusion” es clave para formar estos dominios en vertebrados y cordados. En cambio, en otros linajes, como dípteros (Drosophila y Anopheles), cnidarios (Hydra vulgaris) o plantas, su organización depende del estado epigenético y transcripcional (y, por tanto, del establecimiento de compartimentos A/B). Estas observaciones suscitan importantes reflexiones sobre la evolución de la organización de los TADs, el papel de CTCF y el control transcripcional mediante ERCs de largo alcance. Para una discusión más detallada de estos aspectos nos remitimos a la excelente revisión de Acemel RD y Lupiañez DG (2023).
Enfocándonos en la organización de los TADs en vertebrados, los trabajos iniciales describieron que gran parte de estos dominios se encuentran conservados entre diferentes especies. Esto contrasta con el alto grado de plasticidad en la actividad enhancer entre especies, por lo que los TADs se han postulado como nichos regulatorios donde evolucionan y se ganan/pierden ERCs. En este sentido, la propia organización interna de los TADs contribuye a determinar el patrón de interacciones de nuevos ERCs adquiridos durante el proceso evolutivo (Figura 2A). Así, reordenamientos genómicos que disrumpiesen TADs serían evolutivamente desfavorecidos, debido a la consiguiente desregulación de los genes contenidos en dichos dominios. En cambio, se ha visto que puntos de ruptura sinténicos localizan preferentemente en bordes de los TADs. No obstante, trabajos recientes han demostrado que existe una mayor variabilidad en la localización de los bordes de los TADs, incluso entre especies filogenéticamente próximas con respecto a lo inicialmente postulado. Uno de los ejemplos más destacados es la transición de la organización del clúster de genes Hox de Amphioxus en una única TAD a una organización de dos TADs en los clúster Hox de vertebrados, permitiendo la implementación de complejas estrategias de regulación en diferentes estructuras embrionarias (Figura 2B). Otros trabajos han relacionado cambios sutiles en la localización y/o en la capacidad de aislamiento de los bordes de los TADs con cambios evolutivos en la regulación génica (Figura 2C).
Pese a estos avances, aún se conoce poco sobre las implicaciones funcionales de la mayoría de los cambios evolutivos en la organización de los TADs.
Evolución de los TADs en vertebrados. Esquemas de distintos aspectos de la evolución de los TADs en vertebrados, ejemplificados por el estudio de la organización de los genes Hox. (A) En vertebrados el clúster de genes Hox (representado por el rectángulo negro), se localiza en el borde entre dos TADs (triángulos grises). Dentro de la TAD3’ han evolucionado diferentes enhancers linaje-específicos (p. ej. enhancers para los primordios de glándulas mamarias y vibrisas en mamíferos, enhancers para primordios de plumas y algunos enhancers para extremidades específicos de aves). Incluso ERCs para estructuras evolutivamente conservadas como los somitas (círculos verdes) también muestran una gran plasticidad evolutiva. En serpientes, muchos de estos elementos se han perdido de la TAD3’ y han sido compensados por ERCs ganados dentro del clúster, pero la organización de los TADs se mantiene. (B) La estructura en dos TADs del clúster Hox de vertebrados evolucionó a partir de una estructura de un solo TAD en el clúster Hox ancestral de cordados, representado por el clúster Hox de Amphioxus. En esta especie los enhancers se localizan entre los propios genes Hox (representados individualmente como rectángulos negros). (C) A pesar de su conservación en vertebrados, se han producido cambios sutiles en la organización de los TADs del clúster HoxD de vertebrados, como el cambio de la posición del borde de los dos TADs entre ratón y pollo que se asocia con un cambio en el grupo de parálogos HoxD expresados en el dominio proximal de las extremidades de ambas especies.
Cruzando fronteras
Desde su identificación, los bordes de los TADs han recibido gran atención como elementos aisladores. Sin embargo, trabajos recientes sugieren un escenario considerablemente más complejo. De hecho, estos bordes están enriquecidos en genes “housekeeping” y/o de desarrollo. Por una parte, los primeros dependen principalmente de elementos reguladores proximales, sin requerir interacciones con ERCs de largo alcance, lo que contribuye al aislamiento de los bordes. En cambio, la localización de genes de desarrollo en los bordes de los TADs se ha relacionado con varios aspectos de su regulación. En el caso de los clústeres Hox de vertebrados, su localización entre dos TADs les permitiría interaccionar con ambos dominios reguladores adyacentes dependiendo del tejido, y resultaría en patrones de expresión complejos y dinámicos como los descritos para los genes HoxD durante el desarrollo de las extremidades (Figura 3A).
En otros casos, la localización de genes cerca del borde de sus respectivos TADs favorece la interacción con enhancers de larga distancia, de forma que los sitios CTCF que constituyen dichos bordes actúan tanto como elementos aisladores como de anclaje para interacciones enhancers-promotor (p. ej. Shh, Protocadherins; Figura 3B). A su vez, la localización de estos genes cerca del borde contribuiría a incrementar su capacidad de aislamiento al actuar como atractores de los enhancers de sus propias TADs (Figuras 3B,C). Finalmente, también se han descrito enhancers capaces de interaccionar con sus genes diana a través de bordes de TADs (bystander gene activation), llegando incluso a sortear TADs completos que quedarían segregados aparte, acercando así los TADs del gen y el enhancer en cuestión (Figura 3D).
En resumen, estas evidencias ponen de manifiesto cómo los TADs y sus bordes contribuyen de forma compleja y diversa a las interacciones ERC- promotor.
Diferentes aspectos de la localización de genes de desarrollo en o cerca del borde de TADs. (A) Como se ha explicado en la Figura 2, los genes HoxD de vertebrados se localizan en el borde entre dos TADs, pudiendo ser regulados por CREs de un dominio u otro según el tejido, activando diferentes combinaciones de los mismos en cada estructura (p. ej. dígitos vs porción proximal de las extremidades). (B) La localización cerca de los bordes de los TADs favorece la interacción entre enhancers y promotores, al quedar ambos en la base del bucle formado entre los sitios CTCF que delimitan el TAD, como se ejemplifica en el caso de Shh y el enhancer de extremidades ZRS. (C) La localización cerca del borde también actúa de forma sinérgica con la actividad de los sitios CTCF para potenciar el aislamiento de los TADs, ya que los promotores de los mismos ejercen como ”atractores” de los enhancers, impidiendo que estos ”crucen” el borde. Cambios en la posición relativa de los genes resulta en una disminución del aislamiento entre TADs como queda demostrado para los genes Six3 y Six2. (D) Algunos enhancers pueden cruzar bordes de los TADs para contactar sus genes diana como demuestra el caso del gen Pitx1. En este caso el TAD intermedio queda segregado de los otros de forma que el enhancer y el promotor de este gen quedan espacialmente cerca en la base de los bucles.
Para leer más
- Acemel RD, Lupiáñez DG. Evolution of 3D chromatin organization at different scales. Current Opinion in Genetics & Development 78 (2023) 102019. https://doi.org/10.1016/j.gde.2022.102019
- Bondarieva A, Tachibana K. Genome folding and zygotic genome activation in mammalian preimplantation embryos. Current Opinion in Genetics & Development 89 (2024) 102268. https://doi.org/10.1016/j.gde.2024.102268
- Darbellay F, Duboule D. Topological domains, metagenes, and the emergence of pleiotropic regulations at Hox loci. Current Topics in Developmental Biology, 116 (2016) 299-314. https://doi.org/10.1016/bs.ctdb.2015.11.022
- Davidson IF, Peters JM. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology 22 (2021) 445-464. https://doi.org/10.1038/s41580-021-00349-7
- Maeso I, Acemel RD, Gómez-Skarmeta JL. Cis-regulatory landscapes in development and evolution. Current Opinion in Genetics & Development 43 (2017) 17-22. https://doi.org/10.1016/j.gde.2016.10.004
- Pachano T, Haro E, Rada-Iglesias Á. Enhancer-gene specificity in development and disease. Development 149 (2022) dev186536. https://doi.org/10.1242/dev.186536
