Este importantísimo reconocimiento lo otorgó la Academia: “por sus descubrimientos sobre modificaciones de bases de nucleósidos que permitieron el desarrollo de vacunas de mRNA eficaces contra la COVID-19”. Actualmente se han administrado más de 13 mil millones de dosis de vacunas de ácido ribonucleico (RNA) mensajero (mRNA) en todo el mundo, lo que ha permitido salvar la vida de millones de personas. Por otra parte, el desarrollo de la tecnología del mRNA, no solo permite desarrollar vacunas, sino también contribuir al avance sin precedentes de la lucha contra otras enfermedades.
Sin quitar ni un ápice del mérito que merecen los trabajos de Karikó y Weissman, no solo la modificación de los nucleósidos ha sido de suma importancia para utilizar el mRNA para usos terapéuticos, sino que también el aunar los conocimientos previos en el manejo del mRNA han sido fundamentales en el desarrollo de estas vacunas. A continuación vamos a dar unas pequeñas pinceladas sobre estos avances, así como algunos detalles del desarrollo de las vacunas de este material genético.
El mRNA es una copia temporal encargada de llevar la información que contiene el ácido desoxirribonucleico (DNA) del núcleo al citoplasma celular donde se encuentran los ribosomas, órganos encargados de elaborar proteínas. La ventaja del mRNA de cadena simple frente al DNA es que contiene la cantidad mínima de información genética necesaria para generar la proteína de interés, no interacciona ni produce recombinaciones con el DNA y no hay maquinaria celular para su duplicación intracelular (excepto algunas excepciones). Además, el RNA no puede integrarse en el genoma y por lo tanto no tiene potencial oncogénico. Así, queda patente que este material es meramente transitorio, aumentando su seguridad y eficacia en su uso terapéutico.
Hace años que se había propuesto introducir mRNA específicos en las células como posible terapia para determinados tipos de enfermedades. El problema con el que se encontraban los investigadores era, por una parte, su degradación por ribonucleasas (RNAsas), cuando se intentaban introducirlo en animales, y otra era que inmediatamente se producía una respuesta inmune para destruirlo.
En 2004, Katalin Karikó, Drew Weissman y sus colaboradores observaron que las células dendítricas (CD) toleraban el mRNA de mamíferos, mientras que se producían citoquinas inflamatorias tras la administración de mRNA procedente de bacterias. Además se dieron cuenta que el mRNA endógeno tenía la capacidad inmunomoduladora muy reducida cuando sus nucleósidos estaban modificados con pseudouridina, 1-metilpseudouridina o 5-metilcitidina. Estableciendo de esta forma que las modificaciones postraduccionales naturales de los nucleósidos del mRNA impiden la detección inmunitaria del mRNA endógeno, lo que permite a las células discriminarlo del patológico o invasor. Esto brindó nuevas oportunidades, mediante la incorporación de nucleósidos modificados, se podían producir transcritos de mRNA para usos terapéuticos, tales como las vacunas que evitaban las vías de degradación e inhibición del RNA invasor.
Además de la incorporación de nucleótidos modificados, se han validado otros enfoques para aumentar la capacidad de traducción y la estabilidad del mRNA exógenos, que comentaremos a continuación.
Tecnologías para mejorar los aspectos farmacológicos del mRNA
Las herramientas y material necesario para la transcripción “in vitro” del mRNA se consigue a partir de una plantilla de DNA lineal usando una RNA polimerasa del fago T7, del fago T3 o de Sp6 (Figura 1). Esta plantilla debe contener una caperuza (Cap) en el extremo 5’, un marco de lectura abierto ORF (Open Reading Frame) que codifique la proteína antigénica de interés, dos regiones UTR (UnTranslated Region) que la flanquean y una cola de poli (A). Es decir, el mRNA debe estar diseñado para parecerse a las moléculas de mRNA maduras y totalmente procesadas, que se encuentran de forma natural en el citoplasma de las células eucariotas.
Caperuza, Cap. El mRNA debe contener una “caperuza” en su extremo 5´ que es una molécula de 7-metilguanosina trifosfato. Esta molécula desempeña dos funciones fundamentales: 1) Ser reconocida por el factor elF4E (eukaryotic translation Initiation Factor 4E), iniciador de la traducción; 2) proteger al mRNA de la degradación por las exonucleasas 5’-3’. El añadir esta caperuza al mRNA “in vitro” es complicado y lo que se suele hacer es una adición post-transcripcional. Otra posibilidad es utilizar un análogo de “capping” anti-reverso ARCA (Anti-Reverse Cap Analog), que permite asegurar la orientación correcta de la caperuza en el extremo 5’, mejorar su unión a los ribosomas y aumentar la eficiencia de la traducción.
Regiones no traducidas, UTR. Son necesarias dos UTR que flanquean en 3’ y 5’ la región codificante o marco abierto de lectura, ORF. Las UTR poseen gran importancia en la regulación de la expresión génica ya que hay proteínas adaptadoras que reconocen secuencias específicas, no codificantes que están involucradas en la regulación de la estabilidad y traducción de los genes.
Un marco de lectura abierto aguas arriba (uORF, upstream Open Reading Frame) es un ORF, dentro de la región 5 ‘ no traducida UTR. Los uORF regulan la expresión de genes eucariotas, modulando la tasa de inicio de la traducción de secuencias codificantes posteriores mediante el secuestro de ribosomas.
Región codificante, ORF. La región codificante, ORF, que contiene la información para la síntesis de la proteína, en este caso la espiga S del virus SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome CoronaVirus 2), que va a ser la inmunógena. Esta secuencia tiene que contener al principio el codón del aminoácido metionina (AUG) y finalizar con algunos de los tres posibles codones stop (UAG, UAA, UGA). El diseño de esta ORF tiene que tener en cuenta, aparte de los nucleósidos modificados que hemos comentado, el uso de codones por humanos y, debido a la degeneración del código genético, las especies de RNA de transferencia predominantes, porque varían significativamente entre especies.
Cola de Poli A. Una cola 3’ poli(A) que debe contener entre 120 y 150 nucleótidos. Esta cola regula la estabilidad y traducción del mRNA de forma sinérgica con la caperuza al interaccionar con la proteína denominada PABP (Poly(A) Binding Protein), que forma un complejo con factor eIF4E. Existen diversas formas de añadir esta cola poli(A), desde adicionarla a la hebra molde, hasta adicionarla de forma post-transcripcional mediante la poliadenilación con la enzima poli(A) polimerasa. La longitud de esta poli A cola es un factor determinante en la expresión de proteínas.
Purificación de los mRNAs
El mRNA procedente de la transcripción “in vitro” contiene impurezas que incluyen nucleótidos, oligonucleótidos, fragmentos de transcripción cortos, y proteínas. Estos contaminantes deben eliminarse de la muestra mediante diferentes procesos de precipitación, cromatografía o extracción. Cuanto más puro sea el mRNA obtenido mayor será la eficiencia de la vacuna y menos efectos secundarios tendrán. El uso de la cromatografía líquida de alta eficacia, HPLC (High Performance Liquid Chromatography), para purificar los mRNA, o la cromatografía de afinidad con oligonucleótidos de Poli-T, son los métodos que mejores resultados están dando para su posterior uso clínico.
Métodos de transporte del mRNA hasta las dianas
Existen varias alternativas para hacer llegar este mRNA a la célula diana, unas son usando vectores virales y otras prescindiendo de los mismos para ganar en seguridad, reducción de costes y escalabilidad en su producción. Es decir, es administrarlo en su forma desnuda, encapsulada o asociada a adyuvantes. Sin embargo, el RNA desnudo tiene el problema, aparte de la dificultad de administración, de su degradación por las enzimas RNAsas.
Una forma muy efectiva de transporte y de alcanzar las dianas celulares es la encapsulación del mRNA en nanopartículas lipídicas, LNP (Lipid NanoParticles). Esta formulación ha sido la exitosa para la administración de las vacunas de mRNA, porque aparte de garantizar la estabilidad del mRNA, lo protege de la degradación por nucleasas. Estas LNP/mRNA son captadas de forma eficiente por las células y descargan el RNA en el citoplasma de la célula facilitando su llegada a los ribosomas para la síntesis proteica.
La formulación óptima de estas LNP de mRNA no es sencilla porque son las barreras claves que afectan la eficacia de la trasferencia y deben escapar de degradación endosomal. Por ello se está haciendo un gran esfuerzo en investigación para modificar y optimizar la transición de la carga de mRNA del endosoma al citosol.
La elección de los amino-lípidos (catiónicos o ionizables) y lípidos auxiliares tiene un gran impacto en la disposición estructural y las propiedades funcionales de los mRNA formulados en LNP. Es necesario encontrar un equilibrio adecuado para obtener suficiente estabilidad de partículas en un contexto biológico, mientras que dentro de las células diana la carga de mRNA debe disociarse y los LNP deben promover la liberación endosómica de mRNA.
El mecanismo de la liberación endosómica del mRNA de las LNP dependerá de la mezcla de los lípidos catiónicos de estas nanopartículas y los fosfolípidos aniónicos de la membrana endosómica. La atracción entre estos lípidos promueve la fusión de la membrana y la desestabilización de la membrana, lo que a su vez mejora el escape de las moléculas de mRNA de los endosomas.
En resumen, las LNP deben contener cuatro componentes fundamentales: un lípido catiónico ionizable, que promueve el autoensamblaje en partículas del tamaño de un virus (~100 nm) y a la vez ayuda a la liberación endosómica del mRNA al citoplasma; el polietilenglicol unido a lípidos que aumenta la vida media de las formulaciones; el colesterol como agente estabilizador y facilitador de garantizar, claves, a de la formación de nanocristales; y fosfolípidos naturales, que sostienen la estructura de la bicapa lipídica.
Los mRNA en vacunología
Los dos Premios Nobel 2023 Katalin Karikó y Drew Weissman, como hemos comentado, fueron los que descubrieron que, haciendo una modificación de los nucleósidos el mRNA sintético pasara desapercibido para el sistema inmune. Otros dos científicos, Derrick Rossi y Ugur Sahin se fijaron, con todos los requisitos, eliminar la que hemos señalado, de la tecnología del mRNA modificado con vista a utilizarlo en terapia anticancerígena. Uno de ellos fundaría la empresa Moderna estadounidense, y el otro la alemana BioNTech, que se unió a Pfizer en el desarrollo de la vacuna contra COVID-19. Estas dos compañias BioNTech y Moderna al inicio de la pandemia de la COVID-19 tenían muy avanzada la tecnología y experiencia en vacunología con mRNA, gracias a ello se pudo ir de una forma más rápida en el desarrollo, ensayos clínicos de sus vacunas y aprobación por las agencias del medicamento consecuencia de:
- Los conocimientos adquiridos previos en el desarrollo de vacunas para el SARS-CoV y el MERS-CoV (Middle East Respiratory Syndrome CoronaVirus), se pudo omitir gran parte de la fase de descubrimiento.
- Se pudo iniciar los ensayos de fase I y II a la vez.
- Los ensayos de fase III se iniciaron tras el análisis de datos intermedios de los resultados de la fase II, y se mantuvo en paralelo los ensayos de la fase II y III.
- Durante la fase III se inició la producción a gran escala de las vacunas en desarrollo, asumiendo las empresas el riesgo un fracaso o de la no aprobación por las agencias del medicamento.
- Las dos agencias más importantes la Food and DrugAdministration (FDA) y la European Medicines Agency (EMA), llevaron a cabo una evaluación continua de las vacunas, durante el desarrollo y ensayos clínicos.
El gran avance, la efectividad y la rapidez en la disponibilidad de estas vacunas de mRNA ha sido consecuencia del desarrollo de la tecnología mRNA desarrollada previamente, y en especial a los trabajos de Karikó y Weissmann. Desafortunadamente, los escépticos han aprovechado esta impresionante hazaña de la biomedicina, así como su contribución en la resolución rápida del gravísimo problema de la pandemia de la Covid-19 para debilitar la confianza del público en estas vacunas.
