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Miguel Alcalde

Diseño de enzimas por evolución molecular dirigida

La evolución molecular dirigida es una estrategia revolucionaria de ingeniería de proteínas, anticuerpos o incluso microorganismos completos con características mejoradas. Esta metodología ha permitido el diseño de enzimas con propiedades excepcionales posicionando la biocatálisis en un lugar de privilegio en el arcoíris de disciplinas biotecnológicas.

Las enzimas son biocatalizadores exquisitamente selectivos que pueden acelerar las reacciones químicas en los seres vivos, llevando a cabo las transformaciones más complejas en condiciones muy respetuosas con el entorno natural, a temperatura ambiente, presión atmosférica y en solución acuosa. Por este motivo, se consideran catalizadores verdes y la biotecnología persigue su uso para sustituir los nocivos procesos químicos todavía reinantes en diversos escenarios energéticos e industriales. Sin embargo, trasladar el comportamiento de una enzima desde su ambiente natural a una aplicación de interés para la sociedad, desde la producción de un fármaco a la degradación de contaminantes, no es tarea fácil. Bajo circunstancias alejadas de su ámbito de trabajo natural, la mayoría de las enzimas se inactivan, no son estables o lo suficientemente eficientes por la sencilla razón de que han evolucionado y se han especializado para cumplir con tareas definidas en ambientes celulares muy determinados. Sin embargo, ahora es posible manipular – modificar genéticamente- enzimas al antojo del investigador, para adquirir nuevas propiedades, mejorar y/o adaptar las que ya poseen con el fin último de ser aplicadas en reacciones de interés en el marco de la sostenibilidad y economía circular. Para ello se hace uso de una revolucionaria herramienta conocida como evolución molecular dirigida, que explota el inmenso potencial de la evolución natural para el diseño de enzimas de nuevo cuño. 

La evolución dirigida emula el proceso de evolución natural, pero a escala de laboratorio: mediante ciclos sucesivos de mutagénesis aleatoria, recombinación de ADN y selección se consiguen enzimas más potentes y versátiles, con nuevos atributos, al tiempo que se comprime la escala temporal de la evolución natural, desde miles de millones de años, hasta tan solo meses o semanas de trabajo en el laboratorio. Al contrario de lo que sucede en los procesos de evolución natural, la evolución dirigida no ocurre de manera espontánea durante la reproducción y supervivencia de los individuos, sino que se encuentra bajo el estricto control del investigador, que “dirige” el proceso selectivo en direcciones muy determinadas. Por evolución dirigida se pueden diseñar nuevas selectividades (quimio-, regio- y enantio-selectividades), mejorar estabilidades frente a temperatura, pHs extremos, resistencia a inhibidores o crear nuevas funciones no planteadas en la naturaleza (p.ej. se han diseñado enzimas evolucionadas que llevan a cabo reacciones no naturales para la formación de enlaces C-Si o C-B a través de la apertura de su promiscuidad de función catalítica). 

Figura 1. Representación esquemática de un proceso de evolución dirigida.

El impacto de la evolución dirigida en nuestra sociedad es cuantificable, con decenas de procesos regidos por enzimas evolucionadas en el laboratorio, y que se aplican desde la producción de medicamentos para el tratamiento del cáncer o diabetes, la reducción de la huella de carbono mediante procesos de captura y secuestro de CO2, hasta la producción de nuevas formas de energía renovables. Por todas estas razones, la inventora de esta estrategia de ingeniería de proteínas, la Profesora Frances H. Arnold de CALTECH, fue galardonada por el premio Nobel en Química en la edición del año 2018.

Actualmente, el desarrollo de potentes métodos computacionales predictivos basados en inteligencia artificial (Machine-Deep Learning), permite realizar una evolución dirigida más rápida y eficiente, al tiempo que se suman avances en edición de genomas mediante CRISPR-Cas9 para abordar la evolución dirigida, no solo de enzimas y anticuerpos sino también de complejas rutas metabólicas o incluso microorganismos completos. Junto a estas líneas, el auge de algoritmos de predicción de estructuras 3D de proteínas (AlphaFold2) conducirá en los años venideros hacia una evolución dirigida estructuralmente guiada como nunca antes hubiéramos imaginado. No menos importante, el enorme incremento de secuencias proteicas depositadas en bases de datos a partir de estudios genómicos y metagenómicos, junto con el precio cada vez más asequible para la síntesis de genes, conducen a un extenso portfolio de puntos de partida prometedores, a partir de los cuales se pueden evolucionar enzimas modernas a medida, o incluso permitir la evolución de enzimas ancestrales: Enzimas pertenecientes a organismos ya extintos, cuyas secuencias han sido inferidas filogenéticamente mediante herramientas computacionales y expresadas en microorganismos modernos, i.e. “resucitadas” en el laboratorio.

En nuestro laboratorio del Instituto de Catálisis y Petroleoquímica del CSIC (https://miguelalcaldelab.eu) y en nuestro spin-off (https://evoenzyme.com) estamos realizando esfuerzos sinérgicos para el diseño de enzimas evolucionadas de última generación, quiméricas, modernas y ancestrales, con propiedades híbridas para diferentes fines: Desde la degradación y valorización de residuos plásticos de diferente naturaleza con enzimas promiscuas altamente estables hasta la síntesis de metabolitos de fármacos humanos con enzimas versátiles y selectivas que funcionan a modo de “hígado artificial” para el diseño de nuevos medicamentos.

Referencias:

Molina-Espeja, P., Viña-Gonzalez, J., Gomez, B.J., Martin-Diaz, J., Garcia-Ruiz, E., and Alcalde, M. (2016). Beyond the outer limits of nature by directed evolution. Biotechnology Advances 34: 754-767.

Bornscheuer, U.T., Hauer, B., Erich, K., Jaeger, Schwaneberg, U. (2019). Directed Evolution Empowered Redesign of Natural Proteins for the Sustainable Production of Chemicals and Pharmaceuticals. Angewandte Chemie-International Edition 58: 36-40.

Arnold, F.H. (2019). Innovation by Evolution: Bringing New Chemistry to Life (Nobel Lecture). Angewandte Chemie-International Edition 58: 14420-14426.

Wang, Y., Cao, M., Yu, T., Lane, S.T. and Zhao, H. (2021). Directed Evolution: Methodologies and Applications. Chemical Reviews. In press. DOI: 10.1021/acs.chemrev.1c00260.

Entrevista a Miguel Alcalde

P. ¿Cuándo surgió su vocación científica? ¿Le influyó alguien de forma especial?

R. La biología me enamoró desde pequeño, insectos, plantas, células… en genera comprender el comportamiento de sistemas complejos. Si bien definir mi trayectoria es complicado (Licenciado en Biología especialidad Botánica, Tesina de Licenciatura en Fisiología Vegetal, Tesis Doctoral en Biocatálisis Aplicada..) finalmente mi verdadera vocación científica surgió durante el postdoctorado en el California Institute of Technology (CALTECH), en un ámbito de estudio que realmente me apasiona y constituye el centro de mi investigación actual, el diseño genético de enzimas para sus aplicaciones biotecnológicas. En este sentido la persona que mayor influencia y repercusión ha tenido en mi trayectoria científica ha sido mi mentora en evolución dirigida de enzimas, la Profesora Frances Arnold de CALTECH. La experiencia vivida durante mi postdoctorado con Frances impulsó mi carrera actuando como estimulo, guía e inspiración a lo largo de los años. De Frances recojo su enorme visión, energía y entusiasmo; no menos importante, considero fundamental el aprendizaje inicial con mis directores de Tesis Doctoral los Profesores Antonio Ballesteros y Francisco Plou de los que por encima de todo destaco su gran humanidad y trato cercano con los estudiantes.  De este modo, yo diría que los estudiantes de mi laboratorio reciben una mezcla de ambas filosofías: Para mi es prioritario que el estudiante disfrute con lo que hace, que se sienta implicado y respaldado para que sea productivo y pueda así labrarse un futuro científico, siempre primando la calidad de la investigación sobre la cantidad.

P. ¿Cuáles son desde su punto de vista las características que definen a un buen investigador? ¿Qué consejo daría a los que ahora inician su carrera científica?

R. Desde mi perspectiva, un buen investigador tiene que ser una persona sobre todo honesta, pero también observadora, meticulosa, tenaz y proactiva. Que para cada problema plantee varias posibles soluciones, que tenga iniciativa, capacidad de gestión y liderazgo. Que se preocupe por las personas de su grupo, de su formación, para que disfruten de su actividad investigadora, y que transmita un mensaje que deje huella en las personas que forma, un legado, que cree escuela.

Como consejo a aquellos que inician la aventura científica, les recomendaría que busquen un tema de investigación que les llene y que vayan a por él. Que vivan el día a día, que disfruten del viaje, porque en el fondo los investigadores somos estudiantes de por vida, el compromiso con la ciencia así lo exige.

P. ¿Podría resumirnos brevemente su trayectoria profesional? ¿La repetiría en su totalidad?

R. Mi trayectoria científica comenzó pronto, a comienzos de tercero de carrera ingresé en el grupo de la Catedrática María Eugenia Ron del Departamento de Biología Vegetal de la UCM como tesinando para estudiar el crecimiento de protonemas de esporas de musgos. Fue una etapa muy bonita, ilusionante. A María Eugenia le debo mi iniciación a la investigación. Posteriormente, tras acabar la Licenciatura en Biología y leer la Tesina, me incorporé al grupo del Prof. Ballesteros en el Instituto de Catálisis del CSIC. En ese momento, me comprometí a cambiar de ámbito de estudio, desde la fisiología vegetal/botánica hacia la enzimología/biocatálisis aplicada. Disfruté durante esos años de una gran experiencia, aprendiendo sobre enzimas y biocatálisis aplicada, si bien las herramientas que teníamos para manipular enzimas (mejorarlas para diferentes aplicaciones biotecnológicas) eran por aquel entonces muy limitadas. Esto cambió en mi etapa postdoctoral, donde tuve la enorme suerte de ser aceptado por el grupo de Frances Arnold de CALTECH, que en aquellos años comenzaba a darle forma al concepto de evolución dirigida de enzimas. Esos años en California cambiaron mi vida. Encontré el foco, la motivación e ilusión para profundizar en una herramienta que revolucionaría la forma de diseñar enzimas (como demuestra el reciente premio Nobel en Química que recibió Frances por su invención). Regresé a España con la mochila cargada de ideas y con el incondicional apoyo de Antonio Ballesteros y Francisco Plou, que me permitieron empezar a desarrollar mis primeros experimentos de evolución dirigida en su grupo. Así, conseguí un contrato Ramón y Cajal que me condujo finalmente obtener una posición como Científico del CSIC. El resto fue un disfrute continuo, montar tu propio laboratorio de evolución dirigida, poco a poco, en base a subvenciones, contratos, muchos proyectos y un poco suerte. En todos estos años, he intentado transmitir a mis estudiantes la ilusión por la investigación que desarrollamos, esa ha sido mi prioridad, por encima de todo. En el punto en el que me encuentro ahora, podría decir que ha sido una carrera bonita y exitosa, pero no ausente de obstáculos. Una de las cosas que más me preocupaban, la transferencia de tecnología, también se ha cumplido con creces en base a patentes, desarrollos de proyectos para diferentes industrias, y de manera muy especial, con la creación de nuestro spin-off, EvoEnzyme, una apuesta muy personal de la que me siento particularmente orgulloso y con la que estamos cumpliendo un sueño, al permitir abodar desarrollos que en el ambiente académico no siempre es posible, y salida laboral a los estudiantes más sobresalientes de mi grupo del CSIC. No cambiaría nada de mis decisiones profesionales, me considero un gran afortunado.  

P. ¿Podría describirnos brevemente en que consiste su línea de investigación actual y cuál es su trascendencia? ¿Cómo ve el futuro de esta área científica?

R. Mi línea de trabajo entra de lleno en el campo de la biología sintética, en particular en el diseño de enzimas para aplicaciones energéticas, medioambientales e industriales mediante una herramienta que ha supuesto una revolución biotecnológica y que se conoce como evolución dirigida. Trabajamos en mejorar enzimas en diversos ámbitos aplicando procesos de evolución molecular a la carta en el laboratorio. El futuro de esta área de investigación está en constante desarrollo, y con el auge de los métodos predictivos y la aplicación de procesos de inteligencia artificial, en lo años venideros dispondremos de un portafolio de enzimas evolucionadas que contribuirán a tener un planeta más sostenible.

P. ¿Cuál es el avance científico que más le ha impresionado? ¿Cuál ha sido su mayor sorpresa en el área de investigación en que trabaja?

R. En mi campo de trabajo, los avances producidos en evolución dirigida en los últimos 20 años son muy relevantes (desde los métodos de generación de diversidad genética basados en procesos de recombinación de DNA hasta el desarrollo de sofisticados métodos de ultra-high-throughput screening). 

Más recientemente, tanto el descubrimiento de herramientas para la edición de genomas por CRISP -Cas9, como el  auge computacional de determinación in silico de estructuras tridimensionales de proteínas mediante el uso de inteligencia artificial (AlphaFold2), van a contribuir a la universalización de la biología sintética para la solución de problemas de muy diversa índole.

P. ¿Cuál es su opinión sobre cómo está articulada la carrera científica en España? ¿Qué camino queda por recorrer en Ciencia e Innovación en nuestro país?

R. Tengo el privilegio de ver como funciona el sistema de I+D en nuestro país, tanto desde fuera (como “sufridor”/investigador), como desde dentro al actuar como gestor de la Agencia Estatal de Investigación (AEI). Creo que el sistema es mejorable. En la AEI se lleva a cabo un esfuerzo encomiable para la distribución de los mínimos recursos disponibles en comparación con nuestros socios europeos, pero considero que hace falta una revisión del modelo, uno que sea más independiente de los gobiernos entrantes y/o salientes. La AEI debería disfrutar de partidas presupuestarias definidas y crecientes, comunes por compromiso de todos los partidos políticos. La politización de la ciencia es un drama, una pérdida de recursos y personas, que se forman y no vuelven, un retroceso que gira entorno a una improvisación muy dañina. Asimismo, el crear un tejido industrial sustentado en I+D es clave para cualquier país que se antoje competitivo. Si bien se está haciendo una apuesta por parte de los gobiernos autonómicos y nacional para una proliferación mas bien desordenada de startups tecnológicas, no existe una hoja de ruta clara. 

Perfil biográfico

Miguel Alcalde es Profesor de Investigación en el Instituto de Catálisis y Petroleoquímica del CSIC y fundador de EvoEnzyme, compañía spin-off derivada de su trabajo sobre enzimas diseñadas por evolución dirigida para diversas aplicaciones biotecnológicas.

El Dr. Alcalde es biólogo de formación, con postdoctorado en CALTECH en el grupo de la Prof. Frances Arnold (premio Nobel en Química 2018) y diversas estancias posteriores en CALTECH y UMASS. Coautor de más de un centenar de trabajos sobre diseño de enzimas y biocatálisis aplicada y 14 patentes de invención, ha dirigido 35 proyectos de investigación procedentes de fondos públicos y privados y 12 Tesis Doctorales. Actualmente es gestor de la agencia estatal de investigación y coordinador de la sección de biotecnología molecular y biología sintética de la SEBBM.

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