MÉTODOS. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.
Se pueden utilizar diferentes solventes para la extracción de clorofila a y b. En el trabajo de Porra et al., (1989) se realiza una comparativa de distintos ensayos de ambas clorofilas resuspendidas en varios solventes incluyendo dimetilformamida, metanol y acetona acuosa al 80%. Barnes et al., (1991) describe el uso de dimetilsulfóxido (DMSO) para la extracción y determinación de clorofila a y b. Basado en los hallazgos de Barnes et al., y la baja toxicidad y presión de vapor del DMSO, se concluyó que este era un solvente adecuado para las mediciones de clorofila a y b en el pedestal del NanoDrop One/OneC. Clorofila a pura de espinaca (Sigma-Aldrich® #C5753) y b (Sigma-Aldrich® #C5878) fueron disueltas en 100% DMSO. Para cada suspensión se prepararon diluciones seriadas ½ usando DMSO. Las muestras se almacenaron en tubos ámbar a -20ºC hasta su medición.
MÉTODO PERSONALIZADO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE CLOROFILA
El software para PC de NanoDrop One/OneC permite crear métodos personalizados de cuantificación donde el usuario puede especificar cómo calcular y reportar los resultados. Dicha funcionalidad se utilizó en este trabajo para definir un protocolo customizado de cuantificación de ambas clorofilas.
Se utilizaron los siguientes parámetros:
Se introdujeron fórmulas personalizadas en la tabla de fórmulas para obtener la absorbancia en la longitud de onda de análisis de ambas clorofilas, así como la cuantificación de la concentración de clorofila a y b puras. Se agregaron fórmulas adicionales para obtener la concentración de clorofila a, b y a+b en muestras que contienen una mezcla de ambos pigmentos. Se utilizaron las fórmulas de Barnes et al., (1991) y la localización de los picos se determinó mediante la función de UV-Vis (Figura 1). Posteriormente, el método personalizado fue cargado en la función de “Custom Method” mediante el control local del NanoDrop One/OneC. Dicho método fue ejecutado para cuantificar cada dilución seriada de clorofila a y b por triplicado.
Nota: en este estudio se utilizó la función de UV-Vis para identificar los principales picos de absorbancia de ambas clorofilas y para determinar la longitud de onda del análisis. Si se está usando un solvente diferente a DMSO, se recomienda usar la función de UV-Vis para identificar los picos de las muestras y consecuentemente modificar el método personalizado
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
Para evaluar la reproducibilidad del método, cada dilución de clorofila a y clorofila b se midió por triplicado utilizando el método personalizado definido y previamente descrito. En todos los casos, las desviaciones estándar estuvieron por debajo de 0,0002 Abs (equivalente a 10 mm). Este estudio demuestra que el espectrofotómetro de microvolúmenes de UV-Vis NanoDrop One/OneC se puede utilizar para cuantificar con precisión la clorofila a y clorofila b utilizando un método personalizado definido por el usuario. La baja desviación estándar indica la alta replicabilidad del método lo que valida el NanoDrop One/OneC para cuantificar muestras con precisión y reproducibilidad. La posibilidad de cuantificar clorofila a y b usando un protocolo customizado supone una valiosa herramienta para la investigación y el avance de la ciencia.
REFERENCIAS
1. J.D. Barnes, L. Balaguer, E. Manrique, S. Elvira, and A.W. Davison (1991). A reappraisal of the use of DMSO for the extractions and determination of chlorophylls a and b in lichens and higher plants. Environmental and Experimental Botany. Vol. 32. No. 2, 85–100.
2. R.J. Porra, W.A. Thompson and P.E. Kriedemann. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy (1989). Biochimica et Biophysica Acta. 975, 384–94.
