En este trabajo, mediante el uso de técnicas computacionales, se ha conseguido viajar al pasado para resucitar diferentes ancestros de la proteína Cas9 que pudieron existir hace 2600 millones de años en especies extintas de firmicutes. Las proteínas resucitadas no solo mantienen su actividad de corte, sino que además presentan perfiles más flexibles que las actuales en relación al reconocimiento de secuencia PAM (Protospacer Adjacent Motif) y estructura de ARN guía, lo que las dota de un gran potencial biotecnológico. Además, los ensayos de edición en células humanas demostraron la capacidad de estos ancestros para promover la edición de los genes seleccionados. Este trabajo abre una novedosa e inexplorada vía para el diseño de nuevas herramientas de edición genética que amplíe el catalogo actual de enzimas de edición.
Resumen
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated Cas9 is an effector protein that targets invading DNA and plays a major role in the prokaryotic adaptive immune system. Although Streptococcus pyogenes CRISPR–Cas9 has been widely studied and repurposed for applications including genome editing, its origin and evolution are poorly understood. Here, we investigate the evolution of Cas9 from resurrected ancient nucleases (anCas) in extinct firmicutes species that last lived 2.6 billion years before the present. We demonstrate that these ancient forms were much more flexible in their guide RNA and protospacer-adjacent motif requirements compared with modern-day Cas9 enzymes. Furthermore, anCas portrays a gradual palaeoenzymatic adaptation from nickase to double-strand break activity, exhibits high levels of activity with both single-stranded DNA and single-stranded RNA targets and is capable of editing activity in human cells. Prediction and characterization of anCas with a resurrected protein approach uncovers an evolutionary trajectory leading to functionally flexible ancient enzymes.
febrero 2023
Sobre el grupo investigador
Esta investigación ha sido fruto de un trabajo colaborativo dirigido por el grupo Nanobiotecnología de CIC nanoGUNE (desde enero de 2023, grupo Biología Sintética en CIC bioGUNE) liderado por Raul Perez-Jimenez, con la participación de Francis Mojica (Universidad de Alicante), Lluís Montoliu (Centro Nacional de Biotecnología del CSIC y del Ciber de Enfermedades Raras), Marc Güell (Universidad Pompeu Fabra), Miguel Ángel Moreno-Pelayo (Hospital Ramón y Cajal-Irycis), y Benjamin Kleinstiver (Hospital General de Massachusetts), entre otros.
Referencia del artículo
Borja Alonso-Lerma, Ylenia Jabalera, Sara Samperio, Matias Morin, Almudena Fernandez, Logan T. Hille, Rachel A. Silverstein, Ane Quesada-Ganuza, Antonio Reifs, Sergio Fernández-Peñalver, Yolanda Benitez, Lucia Soletto, Jose A. Gavira, Adrian Diaz, Wim Vranken, Avencia Sanchez-Mejias, Marc Güell, Francisco J. M. Mojica, Benjamin P. Kleinstiver, Miguel A. Moreno-Pelayo, Lluis Montoliu & Raul Perez-Jimenez. Evolution of CRISPR-associated endonucleases as inferred from resurrected proteins. Nat Microbiol 8, 77–90 (2023).
https://doi.org/10.1038/s41564-022-01265-y