En este trabajo, hemos diseñado y caracterizado la proteína ReChb, una nucleasa ancestral reconstruida a partir de ortólogos de Cas12a, capaz de reconocer y cortar tanto ARN como ADN con restricciones mínimas de reconocimiento de PAM. Asimismo, hemos resuelto su estructura mediante criomicroscopía electrónica (cryo-EM) y validado su funcionalidad como herramienta de edición genética en células eucariotas, además de su potencial como herramienta de diagnóstico molecular. Este estudio destaca el enfoque innovador de la reconstrucción ancestral como una estrategia alternativa para desarrollar tecnologías de edición genética que superen las limitaciones de los sistemas CRISPR naturales existentes.
Resumen
The properties of Cas12a nucleases constrict the range of accessible targets and their applications. In this study, we applied ancestral sequence reconstruction (ASR) to a set of Cas12a orthologs from hydrobacteria to reconstruct a common ancestor, ReChb, characterized by near-PAMless targeting and the recognition of diverse nucleic acid activators and collateral substrates. ReChb shares 53% sequence identity with the closest Cas12a ortholog but no longer requires a T-rich PAM and can achieve genome editing in human cells at sites inaccessible to the natural FnCas12a or the engineered and PAM-flexible enAsCas12a. Furthermore, ReChb can be triggered not only by double-stranded DNA but also by single-stranded RNA and DNA targets, leading to non-specific collateral cleavage of all three nucleic acid substrates with similar efficiencies. Finally, tertiary and quaternary structures of ReChb obtained by cryogenic electron microscopy reveal the molecular details underlying its expanded biophysical activities. Overall, ReChb expands the application space of Cas12a nucleases and underscores the potential of ASR for enhancing CRISPR technologies.

febrero 2025
Sobre el grupo investigador
Esta investigación es el resultado de un esfuerzo colaborativo liderado por el grupo de Biología Sintética de CIC bioGUNE, dirigido por el Prof. Raúl Pérez-Jiménez, con la participación del grupo del Prof. I. Ubarretxena-Belandia (Instituto Biofisika), que contribuyó a la resolución de la estructura de la proteína, y del Prof. C.L. Beisel (Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research), quien brindó un apoyo invaluable para demostrar el potencial biotecnológico de la proteína, entre otros.
Referencia del artículo
Jabalera Y, Tascón I, Samperio S et al. A resurrected ancestor of Cas12a expands target access and substrate recognition for nucleic acid editing and detection. Nat Biotechnol. 2024
https://doi.org/10.1038/s41587-024-02461-3