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Silenciamiento sináptico por cannabinoides

Los cannabinoides alteran funciones cerebrales como la memoria porque deprimen la transmisión sináptica en numerosas sinapsis. Los cannabinoides silencian algunas sinapsis por fallo presináptico porque la reducción en la señalización por AMPc dependiente de receptores CB1 altera la maquinaria exocitótica disminuyendo el número de vesículas sinápticas dispuestas para la fusión.
Por José Sánchez-Prieto Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid jsprieto@ucm.es
DOI: http://dx.doi.org/10.18567/sebbmdiv_ANC.2016.07.1

La función cerebral depende de la comunicación rápida entre los miles de millones de neuronas que forman el cerebro. Esta comunicación se realiza en la sinapsis que contienen vesículas sinápticas (VS) cargadas de neurotransmisor (NT) y receptores que se activan con dichos NTs. La transmisión sináptica se inicia con la generación de un potencial de acción que se propaga por el axón y que provoca la apertura de canales de Ca2+ dependientes de voltaje en la zona activa del botón sináptico. La entrada de Ca2+ activa el sensor de Ca2+ sinaptoptagmina e induce la fusión de las VSs con la membrana liberándose el NT. El NT difunde en la hendidura sináptica, activa receptores en la neurona postsináptica y despolariza o hiperpolariza según se trate de un neurotransmisor excitatorio o inhibitorio. La neurona postsináptica integra, en una base temporal y espacial, todas estas señales eléctricas y cuando se alcanza una despolarización suficiente se genera un potencial de acción.

Las sinapsis son el sustrato físico del aprendizaje y la memoria. El cerebro adulto mantiene una cierta capacidad para generar nuevas neuronas. También sabemos que las sinapsis son estructuras con una alta plasticidad que afecta tanto a los botones sinápticos como a las espinas dendríticas postsinápticas. Las sinapsis son pues dinámicas, pueden aparecer nuevas sinapsis, cambiar de forma, y también desaparecer.
Uno de los factores que modulan la transmisión sináptica son los receptores acoplados a proteínas G, GPCRs, (del inglés G protein coupled receptors). Muchos GPCRs reducen la actividad de los canales de Ca2+ reduciendo la probabilidad de liberación de neurotransmisor, aunque también modulan la maquinaria exocitótica afectando al número de vesículas dispuestas para la fusión.

Los endocannabinoides son mensajeros retrógrados que regulan la transmisión sináptica que están implicados en procesos fisiológicos como el apetito, la sensación dolorosa, el estado de ánimo y la memoria. Los endocannabinoides se generan en la neurona postsináptica, difundiendo en la hendidura sináptica y activando los receptores de cannabinoides del tipo 1, CB1Rs, localizados en la neurona presináptica. Los CB1Rs son receptores que activan proteínas G y que suprimen de manera transitoria la liberación de neurotransmisor. Los efectos a corto plazo son atribuidos a la inhibición de la entrada de Ca2+ en los terminales sinápticos. Los receptores de cannabinoides también median efectos de depresión de la fuerza sináptica más duraderos como la LTD (del inglés Long Term Depression) (1).

En los últimos años se ha producido un avance espectacular en el conocimiento del reciclamiento vesicular mediante el uso de sondas fluorescentes (2). Hay sondas que fluorescen a pH fisiológico, pero que se apagan al pH ácido intravesicular, lo que permite estudiar individualmente la respuesta sináptica a los cannabinoides. Esta respuesta se manifiesta como un incremento transitorio de la fluorescencia que corresponde a la exocitosis de las VSs, mientras que el apagado de la fluorescencia se corresponde a la endocitosis hasta la acidificación vesicular (Figura 1A). Con neuronas así transfectadas hemos encontrado que la activación de los receptores CB1 induce el silenciamiento de una subpoblación de sinapsis. Esto es, sinapsis que responden a la despolarización con la exocitosis de las VSs, dejan de hacerlo después de la exposición al agonista cannabinoide. Por tanto, el silenciamiento presináptico afecta a sinapsis funcionales que cuentan con una dotación normal de canales de Ca2+ y de receptores postsinápticos (3). El silenciamiento presináptico es transitorio, no se revierte aumentando la entrada de Ca2+ y afecta sólo a una fracción de las sinapsis que expresan el receptor cannabinoide. Además, el silenciamiento presináptico es consecuencia de la disminución de los niveles de AMPc provocada por el receptor por lo que es revertido por el activador de la adenilato ciclasa forskolina y por los activadores de la proteína Epac (del inglés Exchange protein directly activated by cAMP) (4).

l silenciamiento por cannabinoides afecta a la maquinaria exocitótica y se asocia a un bajo contenido en la proteína de la zona activa presináptica RIM1α (del inglés Rab Interacting Molecule). Las proteínas RIM organizan la zona activa, reclutan canales de Ca2+ y favorecen la formación del heterodímero funcional con Munc13, esencial para la preparación de las VSs para la fusión (5,6). La proteína Munc13 induce la conformación abierta de la sintaxina, lo que promueve la formación del complejo SNARE con las proteínas SNAP-25 y sinaptobrevina, permitiendo así el inicio del proceso de fusión de las VSs. Por tanto, el silenciamiento presináptico dependiente de receptores CB1 es consecuencia de una reducción en la señalización dependiente de AMPc que afecta a la maquinaria exocitótica disminuyendo el número de VSs en las proximidades de la membrana como muestra la microscopía electrónica.

El silenciamiento presináptico podría representar una respuesta extrema de la depresión sináptica inducida por los cannabinoides de aquellos terminales sinápticos con una maquinaria exocitótica más débil y podría ser relevante en la plasticidad cerebral.

Los botones sinápticos de neuronas transfectadas con vGlut1pHluorina (A) pierden la exocitosis tras exposición al agonista cannabinoide HU-210 (B) por retirada de las vesículas sinápticas de la membrana (C). Modificada de Ramírez-Franco et al (2014) PLoS One 9:e88594. doi:10.1371/journal.pone.0088594.
Referencias:
  1. Castillo PE, Younts TJ, Chavez AE, Hashimotodani Y (2012) Endocannabinoid signaling and synaptic function. Neuron 76:70-81.
  2. Bartolomé-Martín D, Ramírez J, Castro E, Sánchez-Prieto J and Torres M (2012) Efficient synaptic vesicle recycling after intense exocytosis concomitant with the accumulation of non-releasable endosomes at early developmental stages. J. Cell Science 125, 422-434. doi: 10.1242/jcs.090878.
  3. Ramírez-Franco J, Bartolomé-Martín D, Alonso B, Torres M, Sánchez-Prieto J (2014) Cannabinoid type 1 receptors transiently silence glutamatergic nerve terminals of cultured cerebellar granule cells. PLoS One 9:e88594. doi: 10.1371/journal.pone.0088594.
  4. Jiang X, Litkowski PE, Taylor AA, Lin Y, Snider BJ, et al. (2010) A role for the ubiquitin-proteasome system in activity-dependent presynaptic silencing. J Neurosci 30: 1798–1809. doi: 10.1523/JNEUROSCI.4965-09.2010.
  5. Deng L, Kaeser PS, Xu W, Sudhof TC (2011) RIM proteins activate vesicle priming by reversing autoinhibitory homodimerization of Munc13. Neuron 69:317-331. doi: 10.1016/j.neuron.2011.01.005.
  6. Kaeser PS, Deng L, Wang Y, Dulubova I, Liu X, Rizo J, Sudhof TC (2011) RIM proteins tether Ca2+ channels to presynaptic active zones via a direct PDZ-domain interaction. Cell 144:282-295. doi: 10.1016/j.cell.2010.12.029.
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Entrevista a José Sánchez-Prieto

P.- ¿Cuándo surgió su vocación científica?

R.- Fue durante mis años en la Universidad cuando estudiaba Farmacia. Los profesores de Bioquímica que tuve, tanto en 3º como en 5º curso, nos hablaban siempre de los últimos avances de la Bioquímica y de los datos que estos nuevos experimentos aportaban. Nos mostraron que la Bioquímica era algo muy vivo que se estaba haciendo en esos momentos. Creo que en esos años decidí que quería participar en ese proceso creativo y dedicarme a la investigación.

P.- ¿Podría resumirnos brevemente su trayectoria profesional?

R.- Realicé la Tesis Doctoral en Bioquímica en la Facultad de Farmacia de la UCM (1982) en el grupo del Dr. M.J. López-Pérez, quien guió mis primeros pasos en la investigación. Hice la Tesis Doctoral siendo ya Profesor Ayudante, de manera que desde el inicio he simultaneado la investigación y la docencia. He realizado estancias postdoctorales en el St. Bartholomew´s Hospital de la Universidad de Londres (1984) (Dr. JB Clark) y en el Ninewells Hospital de Dundee, Escocia, (1986) (Dr. DG Nicholls) donde estudié la bioenergética de los terminales sinápticos y su influencia en la liberación de neurotransmisores. La clarividencia científica de David Nicholls influyó de manera determinante en mi formación. Conseguí una plaza de Profesor Titular en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Veterinaria de la UCM (1988) y mi primer proyecto de investigación como IP (1989) iniciando así mi línea de investigación. Desde entonces he permanecido en la Facultad de Veterinaria, desde el año (2005) como Catedrático de Universidad.

P.- ¿La repetiría en su totalidad?

R.- Desde luego que volvería a dedicarme a la investigación. Quizás cambiaría alguna cosa. Me hubiese gustado realizar una estancia postdoctoral más larga. El hecho de que fuese Profesor Ayudante limitaba las estancias postdoctorales a 6-8 meses, puesto que tenía que realizar las funciones docentes asignadas en el curso. Hoy hubiera realizado una estancia postdoctoral de 3-5 años.

P.- ¿Cuáles son desde su punto de vista las características que definen a un buen investigador?

R.- Un aspecto muy importante es poseer una cierta capacidad de abstracción para plantearse preguntas sencillas. También hay que desarrollar una cierta capacidad de crítica. Un buen científico tiene que creerse todo y a la vez no creerse nada. Se necesita alguna cosa más, pero nada especial: entusiasmo, rigurosidad y dedicación. El entusiasmo por conocer es el motor que impulsa el trabajo de investigación, que nos lleva a hurgar todos los días en los límites de lo conocido y a aprender un poquito más. La rigurosidad en el tratamiento y análisis de los datos es el único camino que nos puede llevar a un hallazgo válido para la ciencia. Los que nos dedicamos a la investigación sabemos, y también nuestras familias, que la investigación no es un trabajo de 8 de la mañana a 3 de la tarde y que cuantas más horas dediquemos mejor y que muchas veces el límite está en lo que uno es capaz de aguantar. Ahora bien, la ilusión y la curiosidad, en definitiva el entusiasmo por el conocimiento, hacen que esta dedicación, a veces un tanto obsesiva, sea siempre una carga liviana, fácil de llevar.

P.- ¿Podría describirnos brevemente en qué consiste su línea de investigación actual y cuál es su trascendencia?

R.- Trabajamos en Neurociencias en una línea de investigación básica que tiene como objetivo entender la señalización de los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs, del inglés G protein coupled receptors) y su acción moduladora sobre transmisión sináptica. Los GPCRs son capaces de iniciar varias señalizaciones simultáneamente, a veces con efectos contrapuestos, por lo que es esencial entender está señalización múltiple. Por ejemplo, el receptor metabotrópico de glutamato, mGlu7 cuando se activa brevemente reduce la liberación del neurotransmisor glutamato porque inhibe los canales de Ca2+ presinápticos, pero una activación prolongada del mismo revierte la inhibición y resulta en una potenciación neta, que es consecuencia del acoplamiento del receptor a la hidrólisis del lípido PIP2 y del acercamiento de las vesículas sinápticas a la membrana plasmática (Martín et al., J Biol Chem 285, 17907, (2010)). Esta señalización paralela con efectos opuestos permite un aumento sostenido de la liberación de neurotransmisor sin aumentar la entrada de Ca2+, que puede ser relevante en formas de plasticidad sináptica que requieran un aumento duradero de la liberación. Los receptores mGlu7 están implicados en diversas patologías como la epilepsia, el dolor neuropático y la ansiedad entre otras, por lo que la identificación de las vías de señalización del receptor implicadas en estos procesos es esencial para una propuesta terapéutica racional. Desde la pertenencia a una red de la RETICS participo, en colaboración con otros investigadores básicos y clínicos, en proyectos de investigación más aplicada tratando de entender la relación entre el glutamato plasmático y el glutamato cerebral para reducir el daño cerebral asociado a un episodio isquémico. Recientemente, hemos propuesto una estrategia terapéutica basada en la diálisis peritoneal para reducir el daño neurológico en pacientes de ictus (Godino et al., J. Clin. Inv. 123, 4359, (2013)), que se está aplicando en un ensayo clínico en fase de realización y que ha generado una patente (PCT WO2013/011166).

P.- ¿Cuál es el avance científico que más le ha impresionado?

R.- El avance en el funcionamiento del cerebro ha sido espectacular aunque todavía se desconoce por ejemplo, como aprendemos o cómo recordamos. También estamos bastante lejos de entender y todavía más de prevenir o curar enfermedades degenerativas como las enfermedades de Alzheimer, Esclerosis Múltiple, Huntington, Parkinson, Esclerosis Lateral Amiotrófica, etc. Muchas de las enfermedades cerebrales son enfermedades sinápticas, por lo que un profundo conocimiento del funcionamiento sináptico y del papel de cada una de las distintas proteínas sinápticas es indispensable para entender las alteraciones que subyacen a estas patologías cerebrales. En el conocimiento sináptico han sido de enorme transcendencia los trabajos de B. Katz, P. Fatt y R. Miledi sobre la transmisión del impulso nervioso y la transmisión sináptica en la unión neuromuscular. Más recientemente, hay que señalar la contribución de T.C. Südhof al conocimiento de cómo la neurona presináptica libera los neurotransmisores mediante la fusión de las vesículas con la membrana plasmática, un proceso que ocurre en menos de un milisegundo. El ingente trabajo de T.C. Südhof ha permitido conocer la función de la proteína Munc18 y de las proteínas del complejo SNARE en la fusión de las vesículas; el papel del Ca2+ y de su sensor sinaptotagmina en la exocitosis; la importancia del complejo RIM/Munc13 en el reclutamiento y preparación de las vesículas y, más recientemente, la influencia de las proteínas pre y postsinápticas neurexina y neuroligina en la formación y función de las sinapsis así como su papel en la esquizofrenia y en el autismo.

P.- ¿Cuál es su opinión sobre cómo está articulada la carrera científica en España?

R.- Cualquier joven graduado que quiera iniciar una carrera científica sabe muy bien que tiene que hacer una Tesis Doctoral y una estancia postdoctoral de varios años que le permita completar su formación y también sabe que cuantas más publicaciones de calidad consiga en este periodo, mejor. Ahora bien, la continuación de la carrera científica en España, hoy, encierra una enorme incertidumbre ya que ni la Universidad ni el CSIC son capaces de integrar a los jóvenes investigadores. Muchos jóvenes o abandonan la carrera científica después de numerosos años de formación o se van fuera de España y esto, de alguna manera, constituye un fracaso que no puede continuar y al que hay que poner remedio. La riqueza científica que tiene un país no es el resultado de lo que se invirtió el mes anterior ni siquiera el año anterior, sino que está determinada por la inversión continuada de muchos años atrás. Además, la formación de un científico es un largo proceso que consume recursos y que un país tiene que saber aprovechar. Esto es lo que hay que entender y, mientras no sea así, estaremos desperdiciando capacidades que podrían contribuir al desarrollo científico y económico de España.

Perfil de José Sánchez-Prieto

José Sánchez-Prieto Borja es Licenciado en Farmacia (1978) y Doctor en Bioquímica (1982) por la Universidad Complutense de Madrid. Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense (2005). Ha realizado estancias postdoctorales en el St. Bartholomew´s Hospital de la Universidad de Londres, Reino Unido, y en el Ninewells Hospital de Dundee, Escocia, Reino Unido. Ha trabajado en investigación básica en Neurociencias, específicamente, en el estudio de los mecanismos presinápticos que modulan la liberación de glutamato por medio de receptores acoplados a proteínas G y de las vías de señalización asociadas. Desde la pertenencia a una red de la RETICS participa en proyectos de investigación más aplicada tratando de entender la relación entre el glutamato plasmático y el glutamato cerebral para reducir el daño cerebral asociado a un episodio isquémico. Es co-autor de más de 90 publicaciones. Ha dirigido 10 Tesis Doctorales. Miembro del Editorial Board del Journal of Neurochemistry (2002-2008).