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RNA polimerasa II, transcribiendo y regulando

La transcripción de los mRNAs es un proceso muy complejo y dinámico en el que participan multitud de factores regulando la actividad de la RNAPII. Dicha actividad además está regulada por tres de sus doce subunidades, Rpb1 y el heterodímero Rpb4/7, esenciales en el mantenimiento de la expresión génica.
Por Olga Calvo Instituto de Biología Funcional y Genómica (IBFG), CSIC-Universidad de Salamanca ocalvo@usal.es
DOI: http://dx.doi.org/10.18567/sebbmdiv_ANC.2020.04.1

La transcripción de los mRNAs es un proceso muy complejo y dinámico, finamente regulado, como muestra la intrincada red de interacciones entre proteínas, y de éstas con ácidos nucleicos. Estas interacciones producen cambios conformacionales en la RNAPII y en su actividad durante las diferentes fases de la transcripción. Así, la actividad de la RNAPII está modulada por Factores Generales de la Transcripción (GTFs) durante la iniciación, por factores de elongación y terminación, y también por una enorme diversidad de complejos actuando como activadores, represores, co-activadores y co-represores. A esto se añade el procesamiento de los pre-mRNAs (capping, splicing y poliadenilación) que ocurre y se regula co-transcripcionalmente y la coordinación entre la transcripción y el estado de la cromatina, lo que regula y facilita el paso de la RNAPII a través de los genes (1). Todos estos procesos están coordinados y regulados de manera específica y diferencial por el estado de fosforilación del dominio carboxilo-terminal (CTD) de la subunidad mayor de la RNAPII, Rpb1 (Figura A). Este dominio se encuentra evolutivamente muy conservado desde protozoos a metazoos y su fosforilación ocurre siguiendo un código extremadamente complejo, que podríamos asimilar al código de modificaciones de las histonas. Dicho código es crucial en la regulación de la transcripción en particular y de la expresión génica en general. Cómo se establece este código, cómo se decodifica y qué factores están implicados, han sido y siguen siendo objeto de numerosísimos estudios desde su descubrimiento hace unos veinte años (2-5). Por lo tanto, la RNAPII es capaz de regular su actividad determinando qué factores y cuándo se asocian a la misma o a los mRNAs durante su biogénesis. Pero no sólo Rpb1, a través de su CTD, tiene esta capacidad.

La RNAPII está formada por 12 subunidades (Rpb1-Rpb12, Figura A), organizadas en cinco módulos estructurales, que en conjunto median la actividad y procesividad de la polimerasa (6,7). Uno de estos módulos es el heterodímero Rpb4/Rpb7, con importantes funciones a distintos niveles de la expresión génica, lo que le ha hecho merecedor de la etiqueta de “regulador maestro” (Figura B). Participa en la transcripción y procesamiento de los mRNAs, en su exporte, degradación y traducción. Para ello, Rpb4/7 es capaz de unirse a los mRNAs y salir al citoplasma unido a ellos. También se ha implicado a Rpb4/7 en la respuesta a estrés y en la reparación del DNA acoplada a la transcripción (8).

En los últimos años nuestro grupo ha contribuido al estudio de las funciones de Rpb4/7, y a la identificación de factores y mecanismos implicados en la regulación de la fosforilación de la RNAPII. Así, descubrimos que Rpb4/7 facilita el acceso de las fosfatasas del CTD, Ssu72 y Fcp1, para su defosforilación y además regula la asociación de otros factores, como Sub1, que modula globalmente la fosforilación de la RNAPII a lo largo de todo el ciclo de transcripción (9,10).
La fosforilación/defosforilación de residuos específicos del CTD es crucial durante la fase de elongación y terminación, y la total defosforilación lo es para el reciclaje de la polimerasa y el reinicio de la transcripción.

Más recientemente, nuestros estudios han permitido esclarecer el papel de la RNAPII en la formación de los bucles génicos (11). En un gran número de genes transcripcionalmente activos, el promotor y terminador de los mismos se yuxtaponen para formar una estructura dinámica denominada “gene loop”. La arquitectura del gen en forma de bucle ocurre por la interacción física entre factores de iniciación y terminación que ocupan las zonas distales de los genes (12). El gene looping se ha implicado en la reiniciación y terminación de la transcripción, en la direccionalidad de la misma, en el aumento de la transcripción mediada por intrones y en la memoria transcripcional. Durante mucho tiempo, y desde el descubrimiento de los bucles génicos, se creyó que la RNAPII era un mero factor pasivo. Dado que el gene looping es un proceso dependiente de transcripción, se presumió, sin demostración, que todas las mutaciones que afectaran a la transcripción, en consecuencia, también afectarían al gene looping (12-14). Sin embargo, nuestro trabajo ha demostrado que esto es erróneo y que la RNAPII juega un papel directo en la formación de los bucles génicos vía Rpb4 al mediar la interacción directa entre dos factores esenciales de este proceso, TFIIB, un GFT, y Ssu72, fosfatasa del CTD y además componente del factor de corte y poliadenilación CPF (15,16). Nuestro trabajo demuestra claramente que Rpb4 desempeña un papel fundamental, no sólo al mediar la interacción de TFIIB y Ssu72 entre sí, sino también con la RNAPII durante la formación de bucles génicos, promoviendo así la transferencia de la misma desde las regiones terminadoras a los promotores para reiniciar la transcripción (Figura C, (11).

El mecanismo/s por el que Rpb4/7 tiene la capacidad de participar en tantos procesos, separados espacial y temporalmente, se desconoce por el momento. Actualmente, parte de nuestras investigaciones van dirigidas a la búsqueda de dicho/s mecanismo/s.

A) RNAPII. B) Funciones de Rpb4/7 en la expresión génica. C) Modelo:Rpb4/7 participa en la formación de los bucles génicos (11).
Referencias:
  1. Bentley, D.L. (2014) Coupling mRNA processing with transcription in time and space. Nat. Rev. Genet., 15, 163-175.
  2. Calvo, O.G., A. (2012) RNA Polymerase II Phosphorylation and gene expression regulation Protein Phosphorylation in human health, 151-194.
  3. Kadonaga, J.T. (2019) The transformation of the DNA template in RNA polymerase II transcription: a historical perspective. Nat Struct Mol Biol, 26, 766-770.
  4. Schuller, R., Forne, I., Straub, T., Schreieck, A., Texier, Y., Shah, N., Decker, T.M., Cramer, P., Imhof, A. and Eick, D. (2016) Heptad-Specific Phosphorylation of RNA Polymerase II CTD. Mol. Cell, 61, 305-314.
  5. Suh, H., Ficarro, S.B., Kang, U.B., Chun, Y., Marto, J.A. and Buratowski, S. (2016) Direct Analysis of Phosphorylation Sites on the Rpb1 C-Terminal Domain of RNA Polymerase II. Mol. Cell, 61, 297-304.
  6. Bushnell, D.A. and Kornberg, R.D. (2003) Complete, 12-subunit RNA polymerase II at 4.1-A resolution: implications for the initiation of transcription. Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 6969-6973.
  7. Liu, X., Bushnell, D.A. and Kornberg, R.D. (2013) RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochim. Biophys. Acta, 1829, 2-8.
  8. Sharma, N. and Kumari, R. (2013) Rpb4 and Rpb7: multifunctional subunits of RNA polymerase II. Critical reviews in microbiology, 39, 362-372.
  9. Allepuz-Fuster, P., Martinez-Fernandez, V., Garrido-Godino, A.I., Alonso-Aguado, S., Hanes, S.D., Navarro, F. and Calvo, O. (2014) Rpb4/7 facilitates RNA polymerase II CTD dephosphorylation. Nucleic Acids Res, 42, 13674-13688.
  10. Garavis, M., Gonzalez-Polo, N., Allepuz-Fuster, P., Louro, J.A., Fernandez-Tornero, C. and Calvo, O. (2017) Sub1 contacts the RNA polymerase II stalk to modulate mRNA synthesis. Nucleic Acids Res, 45, 2458-2471.
  11. Allepuz-Fuster, P., O’Brien, M.J., Gonzalez-Polo, N., Pereira, B., Dhoondia, Z., Ansari, A. and Calvo, O. (2019) RNA polymerase II plays an active role in the formation of gene loops through the Rpb4 subunit. Nucleic Acids Res, 47, 8975-8987.
  12. Hampsey, M., Singh, B.N., Ansari, A., Laine, J.P. and Krishnamurthy, S. (2011) Control of eukaryotic gene expression: gene loops and transcriptional memory. Adv Enzyme Regul, 51, 118-125.
  13. Laine, J.P., Singh, B.N., Krishnamurthy, S. and Hampsey, M. (2009) A physiological role for gene loops in yeast. Genes Dev., 23, 2604-2609.
  14. Singh, B.N. and Hampsey, M. (2007) A transcription-independent role for TFIIB in gene looping. Mol. Cell, 27, 806-816.
  15. Ansari, A. and Hampsey, M. (2005) A role for the CPF 3′-end processing machinery in RNAP II-dependent gene looping. Genes Dev., 19, 2969-2978.
  16. Tan-Wong, S.M., Zaugg, J.B., Camblong, J., Xu, Z., Zhang, D.W., Mischo, H.E., Ansari, A.Z., Luscombe, N.M., Steinmetz, L.M. and Proudfoot, N.J. (2012) Gene loops enhance transcriptional directionality. Science, 338, 671-675.
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Entrevista a Olga Calvo

P. ¿Cuándo surgió su vocación científica?

R. Mi vocación científica surgió muy pronto, cuando estaba en el colegio. Siempre fui una persona muy curiosa y me atraía todo lo que fuera experimentar y manipular cosas. Desde muy joven tuve claro que me gustaba la biología y me suscitaba mucho interés saber cómo funcionaban los seres vivos. Tuve algunas dudas sobre qué tipo de investigación quería hacer, sobre todo por la influencia de algunos profesores, pero cuando tuve mi primer contacto con la Genética, acabando el bachillerato, no me quedó la menor duda de que quería dedicarme a la ciencia y que tendría que ser en el campo de la Genética y la Biología Molecular.

P. ¿Podría resumirnos brevemente su trayectoria profesional?

R. Me licencié y doctoré en Biología por la Universidad de Salamanca. Mi tesis doctoral se centró en el estudio de factores que regulan el inicio de la traducción en Saccharomyces cerevisae y participé en la caracterización de factores implicados en la biogénesis y procesamiento del tRNAiMet. Los estudios que realicé ponían de manifiesto la existencia de la conexión y coordinación entre procesos celulares que se creían separados espacial y temporalmente. Me fascinó el campo de la biogénesis y procesamiento de los RNAs y me intrigaba cómo estos procesos nucleares podrían estar regulando otros procesos celulares como, por ejemplo, la traducción. Por esta razón me trasladé a Nueva York, a Columbia University, para trabajar en el campo del procesamiento de los pre-mRNAs, y en concreto para estudiar la poliadenilación en mamíferos, en el laboratorio del Dr. James L. Manley. Mi trabajo allí fue uno de los primeros en los que se demostró que transcripción y procesamiento de los mRNAs son procesos que no ocurren de manera aislada, sino que están ligados ycoordinados en una compleja red de interacciones. De hecho, en algunos casos estos procesos ocurren casi de manera simultánea. Descubrí la existencia de una interacción entre un coactivador transcripcional (PC4) y un factor de poliadenilación (CstF64) en humanos, interacción que estaba evolutivamente conservada en levaduras a través de Sub1 y Rna15, respectivamente, y que era importante para la terminación de la transcripción. También demostré que algunos factores de poliadenilación son reclutados a las regiones promotoras de los genes. Por entonces, surgió el concepto de procesamiento co-transcripcional y cada vez era más evidente que la fosforilación de la RNAPII jugaba un papel esencial en el mismo. Además, participé en la identificación de la endonucleasa del complejo de corte y poliadenilación, veinte años más tarde de que este proceso se descubriera. Mi reincorporación a la ciencia española como Ramón y Cajal me permitió establecer mi grupo y seguir con las líneas de investigación que había iniciado en NuevaYork, pero que ahora habían derivado a estudiar el papel de algunos factores en la fosforilación de la RNAPII y en la regulación transcripción en general. Desde entonces, hemos aportado nuevos conocimientos al campo con el estudio de factores y complejos que regulan distintos procesos a lo largo de todo el ciclo de transcripción (elongación, splicing, terminación, fosforilación de la RNAPII, gene looping), no sólo de los mRNAs, sino también de otros transcriptos de la RNAPII como los snoRNAs. En los últimos años, además, he participado en importantes proyectos. Por ejemplo, en el estudio del papel de un complejo telomérico en la transcripción de los mRNAs o en la caracterización de la activación de la transcripción por la RNAPI, hasta el momento desconocida. En todos los casos he aportado mi experiencia en Genética, Biología Molecular y Bioquímica.

P. ¿La repetiría en su totalidad? 

R. Si tuviera la ocasión, no, no la repetiría tal cual. A lo largo de mi trayectoria profesional he cometido errores en las decisiones que he tomado y probablemente cambiaría algunas de estas decisiones que afectaron de manera importante a mi carrera científica. Sin embargo, algunos de estos “errores”, a la larga, resultaron ser beneficiosos y de algunos aprendí bastante. Por ejemplo, siempre me he arrepentido de no haber hecho una etapa postdoctoral más larga. He sentido no haber podido explotar más aquella etapa que fue tan fructífera científicamente. Sin embargo, puede que, de haber retrasado mi reincorporación a la ciencia española, quizás hubiera tenido más difícil la vuelta dada la carencia de plazas para científicos que ha habido en nuestro país en los últimos años.

P. ¿Cuáles son desde su punto de vista las características que definen a un buen investigador? 

R. ¡Son muchas! Por citar algunas: el entusiasmo, la pasión, la constancia, la perseverancia, la creatividad, la imaginación, y una gran capacidad para superar la frustración. Además, destacaría la honestidad y la generosidad. Por desgracia, esta última brilla por su ausencia, sobre todo en tiempos donde hay tanta carencia de recursos. A lo largo de mi carrera creo que podría contar con los dedos de una mano los científicos brillantes, líderes en su campo o en su entorno que poseen estas dos cualidades. Mientras sigamos entendiendo la ciencia como una profesión individual, una carrera de galgos, y no como algo colectivo y compartido, y sigamos con el síndrome del “factor de impacto” se perderán muchos y muy buenos investigadores.

P. ¿Podría describirnos brevemente en qué consiste su línea de investigación actual y cuál es su trascendencia? 

R. Actualmente, en mi laboratorio investigamos distintos mecanismos de regulación transcripcional: cómo se regula la actividad de algunas de las subunidades de la RNAPII, cómo participan en la formación de los bucles génicos, o qué papel juegan en la terminación de la transcripción de otros transcritos, como los snoRNAs. En este último caso, además, estamos interesados en la relación funcional entre este proceso y la biogénesis de los rRNAs. Por último, estamos estudiando factores que podrían regular la actividad de las tres RNA polimerasas y que nos ayudarían a entender cómo se comunican los tres complejos enzimáticos y cómo coordinan su actividad durante la activación o la parada del crecimiento. Para ello, utilizamos como modelo de estudio la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Todos los factores y procesos que estudiamos están evolutivamente muy conservados, por lo tanto, los descubrimientos que hacemos son extrapolables a otros eucariotas y por supuesto a humanos, donde la regulación de la transcripción adquiere una importancia extraordinaria en muchos procesos patológicos. Por ejemplo, los bucles génicos se forman en todos los organismos eucariotas y tienen un papel regulador muy importante. Regulan la terminación, clave para la correcta expresión génica. De hecho, este proceso se observa alterado en alguna situación de estrés celular, infecciones virales o mutaciones cancerígenas, de manera que la RNAPII no termina adecuadamente la transcripción de los genes e invade los situados aguas abajo alterando así su transcripción. Esto da lugar a una catástrofe en la expresión génica de manera masiva. Además, los bucles génicos determinan la dirección de la transcripción en los promotores bidireccionales, evitando así la expresión de los ncRNAs que se originan en estos promotores y cuya transcripción está silenciada o muy disminuida para evitar que se pueda alterar la viabilidad celular. A pesar del vasto conocimiento existente sobre la transcripción, la terminación y la formación de los bucles génicos siguen siendo procesos muy desconocidos, y cada vez hay más evidencias que sugieren que son procesos finamente regulados y coordinados. De hecho, conocer cómo se regula la terminación y la formación de los bucles génicos es clave para entender la expresión génica.

P. ¿Cómo ve el futuro de este área científica?

R. Utilizamos como modelo de estudio una levadura y estudiamos un proceso muy básico como es la transcripción. Tengo la impresión de que en España esto no tiene mucho futuro, dada la importancia que se da a la aplicabilidad biomédica o biotecnológica inmediata de los resultados que se obtienen. Los estudios de transcripción interesan si éstos se aplican directamente a la biomedicina, trabajando en levaduras esta aplicación puede ser a muy largo plazo y no obvio. Transcripción y enfermedad interesan, por lo que me temo que los estudios básicos en levaduras cada vez serán menos financiados, aunque los estudios en levaduras han sido y seguirán siendo imprescindibles para descifrar muchos de los mecanismos que subyacen a los procesos celulares más básicos y evolutivamente conservados. Como decía Jacques Monod, Premio Nobel de Medicina en 1965 por sus estudios en la regulación génica: “lo que es válido para las bacterias lo es para los elefantes”.
Por lo tanto, no veo muy claro el futuro, sobre todo en estos días donde parece que las soluciones a los problemas de la sociedad tienen que darse en cuestión de días o meses. El ejemplo más claro es la crisis sanitaria por la que estamos pasando y que pone de manifiesto que la investigación básica es necesaria siempre y que debe ser financiada sin excusas, aunque a priori el conocimiento obtenido no parezca de interés general. ¿A quién podía interesarle hace unos años que los murciélagos portaran unos virus y que fuera importante conocerse su biología? Para mí la respuesta a esta pregunta es obvia. Sin embargo, y espero equivocarme, creo que debido al impacto sanitario y socioeconómico que tiene y tendrá la epidemia que vivimos y a la presión mediática, se financiará sobre todo la investigación que da resultados a corto y medio plazo y claramente aplicables al campo de la biomedicina. Espero confundirme y que no llegue otra etapa de duros recortes en ciencia dada la nueva crisis económica que tendremos que sufrir, para la mayoría de los científicos que, como yo, intentamos entender y explicar cómo funcionan procesos celulares tan básicos, como por ejemplo la transcripción.

P. ¿Cuál consideraría que ha sido el principal avance científico del siglo XX? 

R. Claramente, para mí, el principal avance científico del siglo XX fue el descubrimiento de cómo la información contenida en el ADN es utilizada por las células. Es decir, los descubrimientos que sentaron las bases del Dogma Central de la Biología Molecular, que incluyen el hito principal que fue la resolución de la doble hélice de ADN y el descubrimiento del mRNA como la molécula transportadora de la información genética codificante. Sin estos descubrimientos hoy en día no podríamos estar hablando de mejora genética, terapia génica, biotecnología, etc.
Además, me ha impresionado mucho el avance en las técnicas de resolución de estructuras. Conocer cómo funcionan a nivel atómico los enormes complejos enzimáticos esenciales para la vida, como las RNA polimerasas y los ribosomas, sin duda permitirán importantes avances en biomedicina.

Perfil de Olga Calvo

Olga Calvo realizó su tesis doctoral en el Instituto de Microbiología Bioquímica, centro mixto de la Universidad de Salamanca y el CSIC. Durante este período contribuyó a la caracterización de factores implicados en el inicio de la traducción y su conexión con la transcripción y procesamiento del tRNAiMet. Después se trasladó al laboratorio del Dr. Manley en Columbia University (New York, 1999-2002). Allí trabajó en el procesamiento de los pre-mRNAs y sus estudios fueron pioneros en el descubrimiento de factores implicados en el procesamiento co-transcripcional. Después, realizó una breve estancia en el CRG en Barcelona para continuar con los proyectos iniciados en NuevaYork (2002-2003). En 2004 se incorporó como Ramón y Cajal a la USAL y desde 2009 es Científica Titular del CSIC en el Instituto de Biología Funcional y Genómica (CSIC-USAL), donde ha continuado haciendo importantes contribuciones al campo de la regulación transcripcional.