De entre los múltiples tipos de lesiones que pueden surgir en el DNA, una de las más frecuentes es la generación de sitios abásicos (AP), que en el caso de células de mamíferos aparecen con una frecuencia de entre 10.000 y 50.000 por célula y día. Los sitios AP pueden originarse por la depurinización espontánea de los nucleótidos, o tras la acción de glicosilasas que hidrolizan el enlace glicosídico para eliminar tanto bases nitrogenadas dañadas como el uracilo resultante de la desaminación de las citosinas. La proximidad de sitios AP en las dos cadenas del DNA pueden dar lugar a roturas de doble cadena (DSBs, del inglés Double Strand Breaks) que son las lesiones más peligrosas que puede sufrir el DNA ya que pueden provocar reordenaciones cromosómicas o la muerte celular (Hoeijmakers, 2001), siendo pues su reparación crucial para el mantenimiento de la integridad del genoma.
Las DSBs generadas ya bien sea por proximidad de sitios abásicos, como por otros agentes genotóxicos, como la radiación ionizante, pueden ser reparadas básicamente por dos mecanismos: la recombinación homóloga (HR, del inglés Homologous Recombination), y la unión de extremos no homólogos (NHEJ, del inglés Non homologous End Joining). En la HR la información de una copia intacta del DNA «roto» se emplea como molde para la síntesis de DNA en el sitio de la rotura, de manera que la lesión se repara de manera fiel, de ahí que sea la ruta de reparación principal en bacterias en proliferación, así como durante las fases S y G2 de células eucariotas (Krejci et al., 2003). Por el contrario, debido a que en la NHEJ la unión de los extremos es directa, no se requiere la presencia de una copia adicional de DNA que actúe como molde, siendo una ruta activa a lo largo del ciclo celular eucariota, así como en muchas bacterias que pasan parte de su ciclo vital en estado estacionario en el que solo hay una copia del DNA. Durante la NHEJ, los extremos de la rotura son usualmente procesados por actividades nucleolíticas y/o de polimerización antes del paso final de ligación. Esto hace que el resultado final de la reparación sea una molécula de DNA en la que se han insertado/delecionado uno o varios nucleótidos en el sitio donde se produjo la rotura, por lo que esta ruta de reparación es frecuentemente infiel o mutagénica (Pitcher et al., 2007).
En nuestro grupo estamos interesados en estudiar las características bioquímicas de los componentes del sistema NHEJ bacteriano. Se trata de un sistema mínimo constituido por dos proteínas: un homodímero de la proteína Ku y una proteína multicatalítica denominada Ligasa D (LigD). El homodímero Ku tiene forma de anillo y reconoce la rotura, enhebrando los extremos a través de su canal central (ver Figura 1A). Posteriormente recluta a LigD, que en muchos casos contiene una actividad nucleasa, polimerasa y ligasa, que se encargan del procesamiento de los extremos, el relleno de los huecos (gaps) que surgen cuando se produce la sinapsis entre los dos extremos de la rotura, y de la ligación final de las cadenas, respectivamente (Pitcher et al., 2007). Nuestros últimos resultados han demostrado que si se encuentran sitios AP próximos a extremos 5´ protuberantes de la DSBs, son reconocidos y procesados por Ku gracias a una nueva actividad catalítica denominada AP-liasa que rompe el enlace fosfodiéster 3´ del sitio AP, dando lugar a una pequeña deleción (de Ory et al., 2014). Posteriormente, la LigD es reclutada a la rotura, lleva a cabo el relleno del gap por su actividad polimerasa y finalmente liga el grupo 3´-OH de uno de los extremos de la rotura con el 5´-P, generado tras la actividad AP-liasa de Ku, del otro extremo (ver Figura 1A).
Por otra parte, la presencia de sitios AP en solo una de las cadenas de DNA también puede tener consecuencias mutagénicas y citotóxicas ya que son sitios «no informativos» que las DNA polimerasas replicativas y las RNA polimerasas no son capaces de utilizar como molde durante la incorporación de nucleótidos, pudiendo dar lugar a un bloqueo de procesos esenciales como la replicación y la transcripción. En este caso, la reparación de los sitios AP es llevada a cabo mediante la ruta de reparación por escisión de bases (BER), la más frecuentemente utilizada in vivo y en la que los enzimas que participan están conservados en procariotas y eucariotas (Almeida y Sobol, 2007). El sitio AP es reconocido por una AP-endonucleasa que hidroliza el enlace fosfodiéster 5´ del sitio AP, generando un extremo 5´-deoxiribosa fosfato (dRP) que ha de ser eliminado por una 5´-dRP liasa para generar un extremo 5´-P. El pequeño gap resultante es posteriormente rellenado por una DNA polimerasa que restaura el nucleótido original. Finalmente, los extremos 3´ y 5´ son sellados por una DNA ligasa. Hasta ahora, estas actividades parecían residir en proteínas independientes. Sin embargo, recientemente hemos mostrado cómo la proteína LigD, además de las actividades polimerasa y ligasa ya comentadas anteriormente presenta una actividad 5´-dRP liasa, encargada de sanear los extremos 5´dRP que surgen durante la reparación de sitios abásicos tras la actuación de la AP endonucleasa (de Ory et al., 2016). Hemos demostrado cómo la LigD es capaz por sí sola de reconocer el nick generado por una AP endonucleasa, rellenar el hueco resultante restaurando el nucleótido original, eliminar el extremo 5´-dRP y finalmente sellar las dos cadenas de DNA (ver esquema en Figura 1B). Esta actividad parece ser general de las proteínas LigD ya que tanto la LigD de Bacillus subtilis como la de Pseudomonas aeruginosa la poseen. Además, hemos demostrado in vivo la importancia de dicha actividad, ya que esporas de B. subtilis carentes de LigD y sometidas a daño oxidativo (que es fundamentalmente reparado por la vía BER) presentan una caída drástica de la viabilidad celular.
Estos resultados expanden la intervención de esta proteína en diferentes vías de reparación, haciendo que sea una potencial diana terapéutica para la generación de inhibidores de dicha proteína que podrían conducir a la muerte bacteriana.
Referencias:
- Almeida, K.H., and Sobol, R.W. (2007). DNA repair 6, 695-711.
- de Ory, A., Nagler, K., Carrasco, B., Raguse, M., Zafra, O., Moeller, R., and de Vega, M. (2016). Nucleic Acids Res.44, 1833-1844.
- de Ory, A., Zafra, O., and de Vega, M. (2014). Nucleic Acids Res.42, 13082-13095.
- Hoeijmakers, J.H. (2001). Nature 411, 366-374.
- Krejci, L., Chen, L., Van Komen, S., Sung, P., and Tomkinson, A. (2003). Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 74, 159-201.
- Pitcher, R.S., Brissett, N.C., and Doherty, A.J. (2007). Annu. Rev. Microbiol.61, 259-282.