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miR96: primer microRNA asociado a una patología monogénica de herencia mendeliana

Desde su descubrimiento en los años 90, un nuevo tipo de moléculas reguladoras, los microRNAs, han alcanzado un gran protagonismo al estar implicadas en un amplio rango de patologías, que se caracterizan por exhibir un patrón de expresión génica desregulado, y en el que se encuadran algunos tipos de cáncer. Ahora hemos demostrado por primera vez su asociación a una patología monogénica de herencia Mendeliana, la hipoacusia DFNA50.
Por Miguel Ángel Moreno Unidad de Genética Molecular. Instituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria (IRYCIS) mmoreno.hrc@salud.madrid.org
DOI: http://dx.doi.org/10.18567/sebbmdiv_ANC.2011.01.1

Desde hace una década las miradas se han centrado en los denominados microRNAs (miRNAs), como un nuevo paradigma en el campo de la regulación de la expresión génica. Dichas moléculas son RNAs no codificantes de pequeño tamaño que modulan la expresión de centenares de genes implicados en una gran variedad de procesos biológicos (1). Los miRNAs sufren un procesamiento secuencial por RNasas III a partir de un mensajero primario (pri-miRNA) para generar una molécula precursora de unos 70 pb (pre-miRNA) con estructura de tallo-lazo (Fig. 1a), que es exportada al citoplasma donde es procesada en una segunda etapa para obtener la secuencia madura funcional de unas 20 a 25 pb. El miRNA funciona como un adaptador que permite al complejo inductor de silenciamiento (miRISC) reconocer un mRNA en particular y bloquear su traducción. La secuencia determinante de la especificidad en la interacción entre el miRNA y sus dianas recibe el nombre de región seed. Esta región abarca siete bases, desde la posición 2 a la 8, en el extremo 5′ de la secuencia madura. Las secuencias diana que reconocen los miRNAs se caracterizan por presentar una perfecta complementariedad con la región seed y suelen situarse en la región 3’UT de los mRNAs (2). Los mecanismos de represión postranscripcional mediados por miRNAs incluyen la inhibición directa del inicio de la traducción, la degradación de los péptidos nacientes o la separación prematura de los ribosomas y el mRNA. Parece ser que la intensidad de la regulación va a depender del número de dianas presentes en el mRNA (3). En cuanto a los mecanismos de patogénesis identificados podemos citar la desregulación cuantitativa de un miRNA, como el observado en algunos tipos de cáncer, y la presencia de mutaciones en la región 3’UT de un mRNA que pueden afectar a dianas de microRNAs provocando su desaparición o la aparición de nuevas dianas que llevaría a una regulación inapropiada del gen en cuestión. Sin embargo, hasta el momento no se habían encontrado variaciones en la secuencia madura de un miRNA que estuvieran directamente implicadas en el desarrollo de alguna enfermedad. Esta era la situación existente cuando nuestro grupo consiguió mapear en la región 7q32 un nuevo loci de sordera, denominado DFNA50, tras estudiar una familia que presentaba una hipoacusia progresiva de manifestación postlocutiva (aparece después de haber adquirido el lenguaje) y de herencia autosómica dominante. Una vez excluidos más de una decena de genes candidatos, la suerte hizo que a finales del 2007 un clúster de microRNAs, denominado miR96-182-183 fuera anotado en nuestro intervalo crítico. En ratón los miembros de este grupo de miRNAs se expresaban en células ciliadas y neuronas sensoriales tanto del vestíbulo como de la cóclea y estaban evolutivamente muy conservados, ya que además de en ratón (4) se han localizado en células sensoriales del ojo, epitelio olfativo, neuromastomas y oídos en el pez cebra (5). Dichas características convertían a miR96-182-183 en excelentes candidatos para la sordera DFNA50. La secuenciación de este clúster nos permitió identificar en miR96; un cambio en heterocigosis (G>A) en la secuencia madura del microRNA que modificaba la tercera base de la región seed (Fig. 1A). Obviamente, quisimos ver si ésta u otras mutaciones en miR96 podían explicar la sordera en otras familias de nuestra colección y conseguimos identificar otra mutación en heterocigosis, C>A, que también se localizaba en la región seed (Fig. 1A) y afectaba a la base contigua a la mutada en la primera familia (6). Ambas mutaciones segregaban con la sordera en las respectivas familias y no estaban presentes en población control. ¡¡¡Eureka!!! habíamos identificado la causa de la sordera DFNA50 en un nuevo tipo de gen, un microRNA, y lo que era más fascinante, era el primero implicado en una patología monogénica de herencia Mendeliana. Nuestros hallazgos obtuvieron el respaldo definitivo, cuando el grupo dirigido por la Prof. Karen Steel (Sanger Center, Hinxton, UK) identificó en un modelo de ratón denominado diminuendo, una tercera mutación puntual en heterocigosis en el gen miR96 murino, que también afectaba a la región seed en una base distinta a las mutadas en humano (7). Dicho ratón mostraba una sordera progresiva asociada a la degeneración de las células ciliadas. Alcanzado este punto era evidente que la simple modificación de una base en la región seed en miR96 era suficiente para causar sordera en humano y ratón. Los experimentos posteriores evidenciaron que las mutaciones identificadas en ambas familias impedían el correcto procesamiento de miR96, había una disminución muy significativa de moléculas maduras mutadas, aunque todavía se podían detectar por Northen blot. Sobre esta base diseñamos ensayos de luciferasa que pusieron de manifiesto que las moléculas de miR96 mutantes eran menos eficientes a la hora de silenciar las dianas de miR96 ensayadas (Fig. 1b), y silenciaban de manera más eficiente nuevos genes, que presentaban dianas complementarias a las regiones seed mutadas. Lo mismo ocurría en el caso del ratón diminuendo. De hecho, nuestra hipótesis actual es que las diferencias fenotípicas existentes (edad de manifestación y perfil auditivo) entre las dos familias con sordera DFNA50 podría deberse a un repertorio diferente de dianas desreguladas, cuyo desciframiento arrojará luz sobre los procesos biológicos que se ven afectados, y ayudará al diseño de terapias específicas dirigidas a paliar el deterioro progresivo de la audición en los individuos portadores de estas mutaciones.

A) Estructura tallo-lazo del pre-miR96. B) Ensayo de luciferasa sobre genes diana de miR96.
Referencias:
  1. Nilsen TW. (2007) Mechanisms of microRNA-mediated gene regulation in animal cells. Trends Genet. 23: 243-9.
  2. Bartel, DP. (2009) MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136: 215-33.
  3. Kloosterman WP, Plasterk RH. (2006) The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Dev Cell. 11: 441-50.
  4. Weston MD. y cols. (2006) MicroRNA gene expression in the mouse inner ear. Brain Res. 1111: 95-104.
  5. Wienholds E, y cols. (2005) MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309: 310-1.
  6. Mencía A, y cols. (2009) Mutations in the seed region of human miR-96 are responsible for nonsyndromic progressive hearing loss. Nat Genet. 41:609-13.
  7. Lewis MA, y cols. (2009) An ENU-induced mutation of miR-96 associated with progressive hearing loss in mice. Nat Genet. 41: 614-8.
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Entrevista a Miguel Ángel Moreno

P.- ¿Cuándo surgió su vocación científica?

R.- Es difícil definir cuando surgió mi vocación científica, de hecho creo que fue antes de que tuviera conciencia de lo que esas palabras significaban. Lo que si puedo decir es que quizás surgió desde muy pequeño, ya que siempre tuve mucho interés en descubrir cómo funcionaban los objetos que me rodeaban. No soportaba estar al lado de algo que emitía luces o ruidos sin saber que había dentro, me refiero a mi primera locomotora de tren a pilas, era de carcasa metálica y se desplazaba sin control chocando con todas las sillas y paredes lo que sin duda fue el origen de las primeras desavenencias materno-filiales. En pocos días esa flamante locomotora era un esqueleto, para mi muy atractivo, de una mezcla de cables, lámparas y conexiones. Por supuesto no entendía cómo funcionaba pero creo que es un buen ejemplo que ilustra mi interés por «descubrir» en el sentido más amplio de su significado.  

P.- ¿Cuáles son desde su punto de vista las características que definen a un buen investigador? ¿Qué consejo daría a los que ahora inician su carrera científica?

R.- Creo que son un afán sin medida por la novedad y por el placer que proporciona, que por desgracia es muy efímero, en combinación con la paciencia, perseverancia y mentalidad de un corredor de fondo. La meta la alcanzas en tanto que no te pares. Desgraciadamente muchas veces la meta está lejos o has tomado un camino equivocado y hay que volver a empezar. Mis consejos a los que ahora pretenden iniciar su carrera científica sería que no miren cuanto les queda por recorrer sino que se planteen retos a corto y medio plazo, que vayan cerrando etapas y se vayan preguntando al final de cada una si todavía se levantarían por la mañana con cierta ansiedad pensando en el resultado del experimento que dejaron la noche anterior. Si la respuesta es sí creo que todo está dicho. 

P.- ¿Podría describirnos brevemente en qué consiste su línea de investigación actual y cuál es su trascendencia?

R.- Mi trabajo se encuadra dentro del campo de las sorderas de origen genético, es decir aquellas que se heredan siguiendo las leyes de Mendel. Entre éstas estoy especialmente involucrado en el estudio de las que siguen un patrón autosómico dominante que son en su mayoría de manifestación postlocutiva (aparecen una vez que se ha adquirido el lenguaje) y que progresan con la edad. Nuestro interés no sólo consiste en la identificación del origen genético (mutaciones responsables) de ese tipo de sorderas, sino que nos interesa conocer cuál es el mecanismo de patogénesis asociado y el impacto que finalmente tienen dichas mutaciones sobre la función de la proteína implicada. Esto hace que desde hace unos años hayamos implementado en el laboratorio técnicas de biología molecular y celular para la realización de los ensayos funcionales y para la generación de modelos animales (ratones transgénicos) para las mutaciones que vamos identificando. Entendemos que el desciframiento de los mecanismos subyacentes es la base para el desarrollo de terapias específicas encaminadas en un futuro a paliar o prevenir la hipoacusia en los sujetos afectos.

P.- ¿Cuál es el avance científico que más le ha impresionado?

R.- Aunque hay muchos que me vienen a la mente y que han tenido especial relevancia, me gustaría resaltar el Proyecto de Secuenciación del Genoma Humano, por su trascendencia y por su utilidad para el conocimiento y diagnóstico de las enfermedades hereditarias. Antes de ese hito científico era muy frustrante encontrar, después de mucho esfuerzo, la región del genoma que debía contener el defecto genético y no poder progresar tan rápidamente como ahora (una decena de clicks con el botón izquierdo del ratón) para saber qué genes están anotados en tu intervalo, seleccionar aquellos que son buenos candidatos y empezar a secuenciarlos. Sin duda ha habido un antes y un después desde el desciframiento del genoma humano que ha propiciado entre otras cosas el enorme desarrollo de nuevas herramientas de análisis (microarrays, deep-sequencing, etc.) de tanta utilidad actualmente en las esferas de la investigación y diagnóstico genético. 

P.- ¿Cuál es su opinión sobre cómo está articulada la carrera científica en España? ¿Qué camino queda por recorrer en Ciencia e Innovación en nuestro país?

R.- Creo que por desgracia hemos avanzado poco y mal en este tema. El sistema es obsoleto y solamente dirigido a crear líderes de grupo, al margen de los agravios comparativos que existen entre los investigadores, digamos consolidados, que en función de los distintos caminos que han seguido desde que empezaron su andadura como asistente voluntario en un departamento (o como becario predoctoral si eras un privilegiado) les ha llevado a consolidarse en el sistema de formas muy diferentes (desde contratado laboral a funcionario). Todo sistema que funcione debería estar jerarquizado (ningún ejército puede estar sólo formado por capitanes generales) y permitirte escalar hasta donde en función de tus aspiraciones decidas llegar. En otras palabras hay muchos ámbitos de la investigación que carecen de carrera profesional, como los investigadores que trabajan en el ámbito hospitalario. De algún modo deberían alcanzarse acuerdos serios en materia de investigación que permitan, al margen de las modas políticas, su desarrollo continuado. Creo que los países que asumieron ese reto hace unas décadas están mejor blindados ante los tiempos de crisis.

Perfil de Miguel Ángel Moreno

Miguel Ángel Moreno Pelayo (Cádiz, 1968) es Ldo. en CC. Biológicas (1992) por la UCM. Realizó su tesis de licenciatura en el campo de la embriología y su tesis doctoral en Inmunogenética en el Dpto. de Inmunología del Hospital 12 de Octubre. En 1999, comenzó su etapa postdoctoral en genética humana en el campo de las sorderas hereditarias en el laboratorio del Dr. Richardson (Univ. de Sussex, UK) trabajando en la generación de modelos animales (ratones transgénicos). Desde 2003 es investigador estabilizado I3SNS en la Unidad de Genética Molecular del Hospital Ramón y Cajal, donde dirige la línea de investigación, «Hipoacusias autosómicas de herencia dominante: epidemiología genética, análisis funcionales y generación de modelos murinos». Entre sus principales logros cabe destacar la identificación de dos nuevos genes asociados a sordera autosómica dominante: CCDC50 asociado a la sordera DFNA44; y el primer microRNA (miR96), asociado a un trastorno monogénico de herencia Mendeliana, la sordera DFNA50. Prof. Asociado del Dpto. de Bioinformática de la Universidad Carlos III de Madrid, desde el año 2008 forma parte del panel de expertos de la Comisión Técnica de Evaluación del Instituto de Salud Carlos III.