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La simetría gobierna la reabsorción renal de aminoácidos y nuestras emociones

Los transportadores heteroméricos de aminoácidos (HAT; Heteromeric Amino acid Transporters) son intercambiadores de aminoácidos, que participan en la reab-sorción renal, en la activación de mTOR y en el flujo interórganos de aminoácidos. La estructura de un homólogo procariota de sus subunidades ligeras ha revelado un plegamiento similar al transportador LeuT, paradigma estructural de los trans-portadores de neurotransmisores, con una simetría interna que explica el modo en el que el transportador transloca el sustrato entre ambos lados de la membrana plasmática.

Hay 45 familias de transportadores secundarios (es decir, acoplados a iones, intercambiadores o difusores facilitados) de soluto en las membranas de células humanas. Once de estas familias participan en el transporte de aminoácidos (1). Nosotros descubrimos los únicos de estos transportadores constituidos por 2 cadenas polipeptídicas (subunidad pesada y ligera) unidas por un puente disulfuro, los transportadores HAT (2). Siete HAT se expresan en células humanas, los constituidos por la subunidad pesada 4F2hc y seis subunidades ligeras (LAT1, LAT2, y+LAT1, y+LAT2, xCT o asc1) y el formado por rBAT (cadena pesada) y b0,+AT (cadena ligera). La subunidad pesada es necesaria para el tráfico del holotransportador a la membrana plasmática y la ligera es la subunidad catalítica (1). Los HAT son intercambiadores obligatorios de aminoácidos; sólo intercambian unos aminoácidos por otros. Su función se revela al cooperar junto a otros transportadores en la célula. Así el sistema de transporte b0,+ (rBAT/b0,+AT) es el principal mecanismo de reabsorción renal de cistina. Mutaciones en rBAT o b0,+AT causan cistinuria, aminoaciduria hereditaria caracterizada por la hiperexcreción de cistina y aminoácidos básicos (aa+) en orina (3-4). En el túbulo proximal renal transportadores acoplados a sodio o protones generan un gradiente de aminoácidos neutros (aa0) en el interior de las células epiteliales. El sistema b0,+ acumula cistina y aa+ disipando el gradiente intracelular de aa0, actuando así como un transportador activo. Análogamente, el sistema y+L (4F2hc/y+LAT1) es el mecanismo principal de reabsorción renal de aa+ en el dominio basolateral y sus mutaciones causan la aminoaciduria dibásica LPI (lisinuria con intolerancia a proteínas) (5). Otros HAT como 4F2hc/LAT1 y 4F2hc/xCT están sobreexpresados en tumores, señalizan proteínas clave del metabolismo (p.e. mTOR) y constituyen dianas terapéuticas (1). Son éstos algunos ejemplos para ilustrar el relevante papel de unos intercambiadores de aminoácidos de las células humanas.

Sorprendentemente, la cadena pesada 4F2hc (CD98hc) es un elemento indispensable de la función las integrinas en la adhesión celular (6). En reciprocidad, la adhesión celular podría controlar el transporte de aminoácidos a través de transportadores HAT, lo que explicaría porque la evolución ha dotado a los HAT de cadenas pesadas.

¿Cómo realizan su función los transportadores HAT? La respuesta a esta pregunta permitirá definir los mecanismos moleculares de las mutaciones de cistinuria y LPI, desarrollar inhibidores específicos y entender la relación entre adhesión celular y transporte de aminoácidos. Las bases moleculares de los mecanismos de transporte se están resolviendo desde finales del siglo pasado. En particular, dos estructuras atómicas de transportadores bacterianos han supuesto un gran avance en el transporte de aminoácidos: Gltph (7) y LeuT (8). Estos transportadores son paradigmas estructurales de los que recaptan neurotransmisores como glutamato, GABA, dopamina y serotonina de la hendidura sináptica. Sorprendentemente, el plegamiento molecular de LeuT es compartido por otras cuatro familias de transportadores, entre los que se encuentra el intercambiador de arginina/agmatina de E. coli (AdiC), paradigma estructural de las subunidades ligeras de los HAT (9) (Figura 1a). Los transportadores de estas familias sólo presentan un 10% de identidad de secuencia, pero conservan una pseudosimetría binaria interna (Figu-ra 1b): dos repeticiones relacionadas por su homología estructural pero no por su secuencia. Utilizando esta simetría, el sustrato es transportado mediante el intercambio de conformaciones entre las repeticiones, lo que redunda en la apertura alternativa del transportador a ambos lados de la membrana (Figura 1c).

Así pues, la simetría es de rango superior a la secuencia en estos transportadores. De forma figurada, esta simetría gobierna desde la reabsorción renal hasta el funcionamiento de las sinapsis implicadas en nuestras emociones. Pero hay más. La gran mayoría de los transportadores secundarios, sino todos, presentan algún tipo de simetría estructural. Esto sugiere una evolución que ha combinado dos o más antecesores con capacidad para unir los solutos que transportan. Para mí, este hecho es sin duda la mayor sorpresa en mi área de investigación.

Hemos aprendido mucho, pero todavía tenemos una gran tarea por delante para entender el transporte secundario. No tenemos para uno sólo de estos transportadores las estructuras atómicas de los distintos estados que definen su ciclo de transporte. Además, sólo conocemos la estructura atómica de dos transportadores secundarios eucariotas, los mitocondriales intercambiador ADP/ATP y UCP2. La tarea es enorme, pero la identificación de los mecanismos moleculares de los transportadores secundarios de eucariotas es hoy una empresa factible y fascinante.

Pseudo-simetría binaria del intercambiador de arginina/agmatina AdiC. A) Representación idealizada del dímero de AdiC con el eje de simetría del dímero (flecha negra). Cada protómero (violeta y naranja) está en la conformación abierta-hacia-afuera e incluye la arginina unida en el centro del transportador y próxima el pseudo-eje de simetría binario en cada protómero (óvalos). B) Representación con cilindros de los 10 primeros segmentos transmembrana del protómero de AdiC (izquierda). La Repetición 1 (TM1-TM5, violeta) y la Repetición 2 (TM6-TM10, naranja) se superponen (derecha) mediante rotación (180º) usando el pseudo-eje de simetría binario (flecha). Las divergencias señalan los cambios conformacionales que cada repetición sufre durante la translocación del sustrato. C) Conformación abierta-hacia-adentro de AdiC (gris) basada en la conformación abierta-hacia-afuera (naranjas) usando la pseudo-simetría. Figura adaptada de la ref. 9.
Referencias:
  1. Bröer S, Palacín M (2011) The role of amino acid transporters in inherited and acquired diseases. Biochem J. 436:193-211
  2. Bertran J et al. (1992) Expression cloning of a cDNA from rabbit kidney cortex that induces a single transport system for cystine and dibasic and neutral amino acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 89:5601-5.
  3. Calonge MJ et al. (1994) Cystinuria caused by mutations in rBAT, a gene involved in the transport of cystine. Nat Genet. 6:420-5.
  4. Feliubadaló L, et al.; International Cystinuria Consortium. (1999) Non-type I cystinuria caused by mutations in SLC7A9, encoding a subunit (bo,+AT) of rBAT. Nat Genet. 23:52-7.
  5. Torrents D et al., (1999) Identification of SLC7A7, encoding y+LAT-1, as the lysinuric protein intolerance gene. Nat Genet. 21:293-6.
  6. Feral CC et al. (2005) CD98hc (SLC3A2) mediates integrin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102:355-60.
  7. Yamashita A et al. (2005) Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl- -dependent neurotransmitter transporters. Nature 437:215-223.
  8. Yernool D et al. (2004) Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature 431:811-818.
  9. Kowalczyk L et al..(2011) Molecular basis of substrate-induced permeation by an amino acid antiporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 108:3935-40.

Entrevista a Manuel Palacín

P.- ¿Cuándo surgió su vocación científica?

R.- De pequeño, mi padre me enseñó las tablas de multiplicar, y como premio me contaba el comportamiento de los animales de granja de su pueblo natal en Aragón (Perarrúa; cerca de Graus). Así, en el pueblo, en verano, perseguía y observaba los animales más accesibles para mí, los insectos (¡pobres insectos los que caían en mis manos!). En el pueblo me llamaban el «zagal de los cucos» (cucos por gusanos e insectos en la Ribagorza). Mi madre me inculcó el estudio. El legado fue fantástico, estudiar y aprender toda la vida. En 5º de Bachillerato, en el Colegio Claret de Barcelona, el Padre Bantulà nos mostró que el conocimiento escrito en los libros se puede adquirir en el laboratorio. ¡Qué grande era el Padre Bantulà! No daba misas, sólo clases y todo el tiempo del mundo en su laboratorio. En la España gris franquista, el laboratorio del Padre Bantulà fue mi particular ventana al universo, a un universo lleno de color. 

P.- ¿Podría resumirnos brevemente su trayectoria profesional?

R.- Mas que contestar a esta pregunta, quiero mencionar que el punto más interesante de mi carrera profesional fue cuando alcancé la madurez e independencia para dirigir mi propia investigación, tanto en relación a la temática como a las estrategias experimentales para desarrollarla. ¿Cómo se accede a ese grado de madurez? Hoy el mundo está claramente globalizado. En la Ciencia ya lo estuvo antes, y muchos pudimos trabajar en laboratorios extranjeros donde tuvimos acceso a nuevas preguntas, nuevas tecnologías y nuevas estrategias experimentales. Yo hice dos estancias posdoctorales, una de año y medio en el centro de investigación del Cedars Sinai Medical Center (Los Angeles, CA) con el Prof J Katz estudiando el metabolismo hepático de la fructosa 2,6 bifosfato, y otra de dos años en el Departamento de Fisiología de la Universidad de Zurich. Allí, en el laboratorio del Prof Heini Murer tuve mi bautismo de fuego en Biología Molecular (especialmente dedicado a transporte de solutos a través de membrana), y fue un posdoctoral mucho más aprovechado que el primero. La razón fundamental fue que estaba formado suficientemente como para saber lo que quería, y donde lo quería, con gran exactitud. Así aprendí algo esencial. En la carrera científica es muy importante saber elegir bien, visualizar en cada etapa lo que queremos desarrollar en la siguiente y donde llevarlo a cabo.

P.- ¿Cuáles son desde su punto de vista las características que definen a un buen investigador?

R.- Pregunta difícil de contestar, entre otras cosas porque yo no tengo todas las cualidades que a mí me parecen fundamentales. Quizá la primera sea el esfuerzo y el tesón. Mi director de tesis, el Prof. Emilio Herrera, y mi socio de laboratorio, el Prof. Antonio Zorzano son ejemplos cercanos para mí de esta cualidad. La imaginación se me antoja como otra cualidad imprescindible, pero que curiosamente es más escasa de lo que cabría suponer entre los científicos. Actualmente la Ciencia se ha vuelto tan compleja, requiere de tantos desarrollos técnicos, que la organización para dirigir estudiantes y establecer colaboraciones deviene otra cualidad fundamental. En este sentido debo agradecer a todos mis estudiantes de doctorado y a mis colaboradores posdoctorales por sus contribuciones. Especial mención merece el Dr. José Luis Vázquez-Ibar, que ha transformado mi laboratorio en los últimos años para poder producir proteínas de membrana con calidad para ser cristalizadas. Además, en mi carrera como investigador independiente ha sido fundamental la colaboración con los Profs. Heini Murer, Virginia Nunes, Baruch Kanner, Modesto Orozco e Ignacio Fita (junto con su colaborador Xavier Carpena). Finalmente, como cualidad también incluyo el «hambre», es decir las ganas de aprender. La enumero en último lugar, pero quizá sea la más fundamental. Cuando la Ciencia sacia tu hambre de saber el placer que causa no tiene parangón. En esto último he sido afortunado, he tenido buenos maestros. No puedo dejar de mencionar al último, el Prof. Ignacio Fita. Me ha enseñado cristalografía cuando yo ya superaba los 50 años de edad. ¡Qué regalo aprender a los 50! Definitivamente, las ganas de aprender es la energía que mantiene nuestro esfuerzo y alimenta nuestra imaginación.  

P.- ¿Cómo ve el futuro de su área de investigación?

R.- Como se deduce del artículo que acompaña a esta entrevista me dedico al estudio del transporte de aminoácidos en células humanas. En los años 70 del siglo pasado se definieron de forma fenomenológica los sistemas de transporte a través de las membranas celulares. En los años 80 y 90 se clonaron la mayor parte de los transportadores que median el paso de solutos, incluidos los aminoácidos, a través de las membranas celulares de mamíferos. En este ámbito, sin embargo, la tarea no está finalizada y existen todavía transportadores huérfanos de sustratos en humanos, y especies de interés sanitario sin una descripción completa de sus sistemas de transporte. A caballo de la Genómica Funcional desde entonces se están identificando los procesos fisiológicos en los que intervienen estos transportadores y su forma de regulación. En este sentido, esta área evoluciona pareja a otras como pueden ser señalización celular, ciclo celular, por citar algunos ejemplos. Contrariamente a otras áreas de investigación, y debido principalmente a su naturaleza hidrofóbica, el transporte de solutos (y también de iones) a través de membranas ha sufrido un claro retraso en la resolución de estructuras atómicas. Hay unas 70.000 estructuras depositadas en el Protein Data Bank, pero sólo menos de 800 de proteínas de membrana, incluyendo transportadores, ATPasas, canales, receptores y enzimas. La primera estructura de una porina se publica en 1992, una F1-ATPasa en 1994, una bacteriorrodopsina en 1996, un canal de potasio en 1998, una aquaporina en 2000, un transportador ABC (ATP Binding Cassette) en 2002 y de transportadores de solutos en 2003. Desde entonces viene produciéndose una explosión de nuevas estructuras de diferentes transportadores. En los próximos 5 años asistiremos a una descripción del ciclo de transporte de muchos transportadores en forma de estructuras cristalinas, y el siguiente paso será conocer los mecanismos moleculares que desencadenan los movimientos conformacionales del transportador una vez han unido sus sustratos. Aquí será necesario el acceso a ordenadores que permitan estudios de dinámica molecular en el rango de decenas de microsegundo. El cuello de botella actual es la resolución de estructuras de transportadores eucariotas, incluidos los humanos. De nuevo creo que los próximos 5 años desvelarán muchas estructuras eucariotas. Estas estructuras atómicas supondrán un avance significativo que nos permitirá diseñar inhibidores, identificar los mecanismos moleculares de regulación y desarrollar una ingeniería de transportadores para el desarrollo de nanomáquinas para el transporte de moléculas a través de membranas. 

P.- ¿Cuál consideraría que ha sido el principal avance científico del siglo XX?

R.- En el ámbito de la Biología son varios, pero para mí es el nacimiento y desarrollo de la Biología Estructural en la segunda mitad del siglo pasado. La estructura de la doble hélice del DNA (1953) marca el comienzo del tremendo desarrollo de la Biología Molecular, que ha llevado a otro hito a caballo de los siglos XX y XXI, la secuenciación de genomas eucariotas. Por otro lado, la resolución de la estructura atómica de la mioglobina y de la hemoglobina (1960) inicia un desarrollo progresivo e imparable de la Biología Estructural de proteínas (de 2 a 70.000 estructuras en 50 años). La secuencia de los genomas y todas estas estructuras de proteínas dan un marco de referencia funcional y espacial, que está permitiendo desarrollar todos los ámbitos de la Biología (y de áreas aplicadas como la Farmacología) y nos está llevando a una explicación de la Fisiología de carácter molecular y matemático (Biología de Sistemas). Además del tremendo valor añadido de estos avances, el desafío conceptual que supuso el desarrollo de la Biología Estructural de macromoléculas es de una belleza cegadora. Los gigantes que realizaron estos avances dotaron a la humanidad con otros «ojos», otros sentidos que no son los naturales, para «ver» estructuras basándose en difracción de rayos X (1960) y en Resonancia Magnética Nuclear (1989). Simplemente, fascinante.

P.- ¿Qué camino queda por recorrer en la Ciencia e Innovación en nuestro país?

R.- Desde el advenimiento de la democracia en España el camino recorrido en Ciencia ha sido enorme tanto desde el punto de vista cualitativo como cuantitativo. La creación de la ANEP y los Planes Nacionales de Investigación, y el aumento de dotación económica en los 80 para proyectos de investigación y formación de doctores y posdoctorales fueron los mecanismos que claramente contribuyeron a nuestra mejora. En los últimos 10 años se ha dado otro salto de calidad con la generación de nueva planta de centros de investigación con voluntad de llegar a ser referentes mundiales, y en donde la forma de hacer no es funcionarial y se estimula la contratación de científicos de gran nivel independientemente de su nacionalidad. Incluso se han construido instalaciones de referencia mundial como un sincrotrón, por citar alguna. A pesar de todo ello sigue habiendo marcadores que indican que la posición de la Ciencia en España frente a nuestro entorno es pobre. Estamos por debajo de la media de la Unión Europea en porcentaje del PIB destinado a Ciencia e Innovación, en el número de científicos por habitante y en el número de patentes generadas y en uso. Ahora que la crisis económica nos golpea estamos asistiendo a una reducción continuada de los recursos destinados a la Ciencia en España. Esto ocurre además en una fase crítica. Hemos crecido mucho, pero todavía hay una distancia significativa en el desarrollo de la Ciencia en España frente a la de los países más desarrollados. Un ejemplo, nuestros (por los que trabajan en España) investigadores senior, excepto brillantes y contadas excepciones, casi no tienen acceso a los proyectos europeos ERC (European Research Council). Otro ejemplo, la caída del número de proyectos de investigación del Plan Nacional, de nuevo excepto honrosas y brillantes excepciones, en la Universidad española ha sido dramática en los últimos años. El último ejemplo: la dotación económica anual del Fondo de Investigaciones Sanitarias (FISS) para centros y proyectos de investigación es menor que los presupuestos anuales del Real Madrid y el FC Barcelona por separado. Nuestros administradores están además lógicamente preocupados por conseguir mayor retorno económico de nuestra inversión en Ciencia. En esta situación la resultante más fácil es crear «burbujas de excelencia» y primar la innovación sobre la Ciencia básica. Craso error. Se ha de estimular, mediante el círculo virtuoso de dotación económica y evaluación, el acceso a la relevancia internacional de todas las instituciones de Ciencia en España, incluida la Universidad y el CSIC ¿Cómo mantendremos una cúspide de excelencia sin una base sólida? Sirvan estas palabras del Premio Nobel Tom A. Steiz por su contribución a la estructura del ribosoma para la disyuntiva ciencia básica/aplicada: «Our work reinforces my view of the importance of research funding agencies continuing to emphasize their support of basic research rather than divert their efforts to «translational» research, which I believe has a more limited horizon for novel discoveries (Nobel lecture in 2009)». España necesita que sus sistemas productivos y financieros se dediquen a la generación de innovación y desarrollo en nuestro territorio, y no a malgastar el dinero que no teníamos a construir casas que no necesitamos. En nuestro país falta criterio y auténtico sentimiento patriótico, también en la Ciencia. Implementamos planes mal definidos, que posteriormente modificamos sin criterio. ICREA (Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats) creó en 2002 el programa ICREA junior para jóvenes investigadores como entrada a una carrera científica («tenure track») financiando el salario del investigador durante cinco años. Permitió que estos investigadores formaran parte de equipos grandes establecidos, no dotó de financiación económica la investigación a realizar («start-up funding»), no realizó un seguimiento de su tarea, y en el cuarto de cinco años únicamente les ofreció acceso a un número muy limitado de plazas del programa de ICREA senior exigiéndoles independencia científica en competencia con investigadores de cualquier edad y etapa de madurez. Este hecho demuestra lo mal que organizamos la Ciencia en España, en especial para aquellos que están en el tránsito de ser investigadores independientes.

Perfil de Manuel Palacín

Estudió Biología en la Universitat de Barcelona (UB) y se doctoró en la Universidad de Alcalá de Henares (1983) por su trabajo en transporte placentario de nutrientes bajo la dirección de los Profs. Miguel Ángel Lasunción y Emilio Herrera (Hospital Ramón y Cajal de Madrid). Fue Profesor Titular de Fisiología en la Facultad de Medicina de la Universidad de Extremadura (1984-86), donde estudió con el Prof. José Viña el papel del ciclo de Meister en el transporte de aminoácidos en placenta. En el periodo 1986-1987 estudió con el Prof. Joseph Katz (Cedars Sinai Medical Center, Los Angeles, CA, EEUU) la zonación del metabolismo hepático de fructosa 2,6-bifosfato. Profesor Titular (1987) de Bioquímica y Biología Molecular (BQBM) en la UB, compatibiliza su docencia con la colaboración con el Prof. Heini Murer (Universität Zürich) clonando la cadena pesada rBAT, descubriendo así los Transportadores Heteroméricos de Aminoácidos (HAT) (1992). Catedrático BQBM en la UB (1995). En Barcelona identifica dos genes de cistinuria y el gen de lisinuria con intolerancia a proteínas (1999). Es Jefe de grupo en el IRB Barcelona (2002), donde resuelve la estructura atómica de un homólogo procariota de las subunidades ligeras de los HAT (2011).