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La cara y cruz de la vía SHH en el desarrollo de las extremidades

La vía de señalización Sonic Hedgehog (SHH) controla la identidad y el número de dedos que se forman en nuestras extremidades. Múltiples estudios están revelando cómo alteraciones cis-reguladoras en los paisajes genómicos de los componentes de esta vía han contribuido a la diversificación evolutiva de la extremidad de tetrápodos, pero también subyacen a la aparición de defectos congénitos de la misma.

En la maravillosa película “La princesa prometida”, el espadachín Íñigo Montoya buscaba incansablemente al hombre con seis dedos que había asesinado a su padre. Este tipo de malformaciones de la extremidad no son tan raras como pudiera parecer, llegando a afectar a 1 de cada 500 nacimientos, aunque con frecuencia se corrigen en la infancia mediante cirugía. Uno de los principales mecanismos moleculares implicados, de forma directa o indirecta, en el desarrollo de más de cinco dedos son aquellos mediados por la vía de señalización Sonic Hedgehog (SHH). Este ligando se produce en el mesénquima posterior de la extremidad embrionaria durante el desarrollo y controla tanto el número de dedos que se forman como su identidad a lo largo del eje antero-posterior (pulgar-meñique). Así, ratones en los que el gen Shh está inactivado presentan extremidades truncadas, con fusiones de los huesos del antebrazo y ausencia de muñeca y dedos. La vía SHH tiene funciones pleotrópicas durante el desarrollo, por lo que estos mutantes también presentan malformaciones severas en múltiples tejidos, incluyendo el sistema nervioso central, y mueren durante la gestación. Por su parte, ratones que portan alelos de pérdida de función en el factor de transcripción GLI3, un regulador negativo de la vía SHH, mueren igualmente durante el periodo embrionario y presentan defectos variados, incluido la formación de entre 6 y 9 dedos. El eje SHH-GLI3 es muy antiguo evolutivamente, y también opera durante el desarrollo de las aletas en peces. Recientemente, hemos demostrado que la inactivación del gen gli3 en pez medaka lleva a la formación de aletas más grandes con múltiples huesos adicionales [1], lo que recuerda a la polidactilia que aparece en ratones deficientes en Gli3 [2], o en pacientes que portan mutaciones en heterocigosis en GLI3. Tanto en ratón como en pez medaka, la pérdida de función de este gen lleva a la sobrexpresión de varias dianas transcripcionales de la vía SHH que codifican para reguladores de proliferación celular. Los peces no tienen dedos, pero estos resultados indican que existe una relación evolutiva muy profunda entre el esqueleto endocondral de los peces y la mano de los tetrápodos, y que ambos utilizan mecanismos similares para controlar su tamaño.

La expresión de Shh en la extremidad embrionaria de vertebrados está controlada por un elemento cis-regulador muy lejano denominado ZRS. La deleción en homocigosis del ZRS en el ratón fenocopia únicamente la pérdida del esqueleto distal que se observa tras la inactivación constitutiva de Shh, sin otros defectos aparentes. En humanos existe una rara malformación autosómica recesiva denominada aqueiropodia caracterizada por el truncamiento distal del esqueleto de brazos y piernas, con aplasia completa de manos y pies, pero sin defectos en otros órganos. Se han descrito dos deleciones en pacientes con aqueiropodia: la primera, de 102 kb, incluye el ZRS humano; la segunda, de 12 kb, no afecta al ZRS, sino que la región eliminada contiene sitios de unión para CTCF y está implicada en el plegamiento de la cromatina, de manera que, en su ausencia, el elemento ZRS no puede interaccionar con el promotor de SHH [3]. En contraposición, existen duplicaciones y múltiples mutaciones puntuales descritas en el ZRS humano (y de otras especies, incluidos los famosos gatos de Ernest Hemingway), pero estas típicamente dan lugar a fenotipos de ganancia de función y expresión ectópica de Shh, lo que produce polidactilias y/o pulgares con tres falanges [4].

El registro fósil nos indica que todas las morfologías presentes en los tetrápodos actuales derivan de la modificación de un patrón esquelético ancestral con cinco dedos. Dada la relevancia de la vía de SHH para el desarrollo de las extremidades, no resulta sorprendente que alteraciones en esta vía hayan contribuido a la diversificación evolutiva de las mismas. El caso más extremo es el de la pérdida de completa de extremidades, que ha ocurrido de forma convergente en múltiples linajes (serpientes, cecílidos, patas posteriores en cetáceos, etc.). Por ejemplo, Shh se expresa de forma muy residual en el primordio de la extremidad posterior de la serpiente pitón, lo que correlaciona con un esqueleto vestigial y la acumulación de mutaciones inactivantes en la secuencia ZRS de serpientes [5,6]. Otro caso paradigmático de evolución morfológica son las extremidades de artiodáctilos, como vacas o cerdos. Estos animales corren velozmente gracias a manos simétricas en las que sólo dos dedos centrales soportan el peso del animal, mientras que los otros dedos se han perdido o miniaturizado. Nuestros trabajos han revelado que la expresión de Ptch1, que codifica el receptor de SHH, se encuentra alterada en la extremidad embrionaria de vaca y cerdo en comparación con el ratón, y que las consecuencias en la activación de la vía SHH se correlacionan con la pérdida de asimetría en la mano de artiodáctilos y, de forma secundaria, con la reducción en el número/tamaño de dedos [7,8]. Además, identificamos que el enhancer LRM, que controla la expresión de Ptch1 en la extremidad embrionaria, ha degenerado funcionalmente en el genoma de estos animales.

En su conjunto, estos estudios ilustran cómo alteraciones reguladoras proporcionan la plasticidad necesaria para que grandes redes de regulación morfogenética, con funciones pleiotrópicas y esenciales, acomoden cambios de expresión (niveles y/o espacio-temporales) que contribuyan a la aparición de novedades evolutivas, en este caso de la extremidad. Al mismo tiempo, mutaciones reguladoras en estos mismos paisajes genómicos pueden dar lugar a variantes alélicas que interfieren con el desarrollo embrionario en humanos, causando malformaciones congénitas de brazos y/o piernas.

Figura 1. Alteraciones cis-reguladoras en vías morfogenéticas de la extremidad de tetrápodos
Referencias:
  1. Letelier, J., Naranjo, S., Sospedra-Arrufat, I., Martinez-Morales, J.R., Lopez-Rios, J., Shubin, N., and Gómez-Skarmeta, J.L. (2021). The Shh/Gli3 gene regulatory network precedes the origin of paired fins and reveals the deep homology between distal fins and digits. Proc Natl Acad Sci U S A. 118, e2100575118.
  2. Lopez-Rios, J., Speziale, D., Robay, D., Scotti, M., Osterwalder, M., Nusspaumer, G., Galli, A., Holländer, G.A., Kmita, M., and Zeller, R. (2012). GLI3 constrains digit number by controlling both progenitor proliferation and BMP-dependent exit to chondrogenesis. Dev. Cell 22, 837–848.
  3. Ushiki, A., Zhang, Y., Xiong, C., Zhao, J., Georgakopoulos-Soares, I., Kane, L., Jamieson, K., Bamshad, M.J., Nickerson, DA., University of Washington Center for Mendelian Genomics, Shen, Y., Lettice, L.A., Silveira-Lucas, E.L., Petit, F., and Ahituv N. (2021). Deletion of CTCF sites in the SHH locus alters enhancer-promoter interactions and leads to acheiropodia. Nat Commun. 12, 2282.
  4. Anderson, E., Peluso, S., Lettice, L.A., and Hill, R.E. (2012). Human limb abnormalities caused by disruption of hedgehog signaling. Trends Genet. 28, 364-73.
  5. Kvon, E.Z, Kamneva, O.K., Melo, U.S., Barozzi, I., Osterwalder, M., Mannion, B.J., Tissières, V., Pickle, C.S., Plajzer-Frick, I., Lee, E.A., Kato, M., Garvin, T.H., Akiyama, J.A., Afzal, V., Lopez-Rios, J., Rubin, E.M., Dickel, D.E., Pennacchio, L.A., and Visel A. (2016). Progressive Loss of Function in a Limb Enhancer during Snake Evolution. Cell 167, 633-642.
  6. Leal, F., and Cohn MJ. (2016). Loss and re-emergence of legs in snakes by modular evolution of Sonic hedgehog and HOXD enhancers. Curr Biol 26, 2966-2973.
  7. Lopez-Rios, J., Duchesne, A., Speziale, D., Andrey, G., Peterson, K.A., Germann, P., Unal, E., Liu, J., Floriot, S., Barbey, S., et al. (2014). Attenuated sensing of SHH by Ptch1 underlies evolution of bovine limbs. Nature 511, 46–51.
  8. Tissières, V., Geier, F., Kessler, B., Wolf, E., Zeller, R., and Lopez-Rios, J. (2020). Gene regulatory and expression differences between mouse and pig limb buds provide insights into the evolutionary emergence of artiodactyl traits. Cell Rep. 31, 107490.

Entrevista a Javier López-Ríos Moreno

P. ¿Cuándo surgió su vocación científica? ¿Le influyó alguien de forma especial?

R. Crecí viendo los documentales de Jacques Cousteau y leyendo los libros de Gerald Durrell, y creo que esas fueron las influencias más importantes que despertaron mi fascinación por la naturaleza. Durante mi adolescencia, el inicio del proyecto genoma humano, unido a la lectura de Stephen Jay Gould, motivaron mi deseo de estudiar Biología Molecular.

P. ¿Recibió de joven algún consejo al cuál siga siendo fiel?

R. Muchísimos, y los sigo en mi vida personal y profesional. El más importante viene de mis padres, y es seguir la máxima de que siempre pasa lo mejor, que hay que mirar el lado positivo en todo. Considero esencial este optimismo como actitud vital en el laboratorio. Incluso si un proyecto no va bien o un experimento falla, por las razones que sean, es importante no considerarlo necesariamente un fracaso, sino una oportunidad de adquirir experiencia, conocimiento y habilidades para solucionar futuros problemas.

P. ¿Podría resumirnos brevemente su trayectoria profesional? ¿La repetiría en su totalidad?

Hice mi tesis doctoral en el Instituto Cajal bajo la dirección de Paola Bovolenta, estudiando el papel de los genes de la familia Six en el desarrollo de ojo en embriones de pez medaka y pollo. Este periodo fue fantástico, puesto que me permitió interaccionar con una gran cantidad de grupos e investigadores con los que sigo en contacto y colaborando hoy en día. En este punto, decidí que quería trabajar en el modelo de ratón, puesto que en aquel momento era el único vertebrado en el que se podían introducir mutaciones precisas en el genoma, gracias a la recombinación homóloga en células madre embrionarias. Para ello, me uní al grupo dirigido por Rolf Zeller en la Universidad de Basilea, con quien estuve casi ocho años, tras los cuales conseguí una posición de investigador principal junior en el departamento de Biomedicina. En estos periodos estudié los mecanismos moleculares que controlan el desarrollo de la extremidad en el ratón, principalmente aquellos mediados por la vía de señalización Hedgehog. Esta etapa en el extranjero fue fundamental para mi, y me permitió madurar como investigador y definir mi trayectoria científica independiente, además de darme la oportunidad de interaccionar con muchos investigadores excelentes por todo el mundo. En el 2017, me trasladé al Centro Andaluz de Biología del Desarrollo en Sevilla, que es un sitio con una dinámica y excelencia científica increíble.

Respecto a si repetiría mi carrera en su totalidad, la respuesta es un rotundo sí, puesto que he tenido mentores y colegas magníficos, y he podido realizarme científicamente. Por supuesto que ha habido cosas que me hubiera gustado que salieran de otro modo y he tratado de corregir errores y aprender de ellos pero, por convicción personal, nunca me arrepiento de mis decisiones. Dicho esto, también creo que he sido afortunado en mis elecciones, ya que también hay un gran componente de azar en la carrera investigadora.

P. ¿Cuáles son desde su punto de vista las características que definen a un buen investigador? ¿Qué consejo daría a los que ahora inician su carrera científica?

R. Evidentemente un buen investigador ha de ser íntegro y éticamente impecable, a todos los niveles, esto se presupone, así como su vocación científica, que considero fundamental. Pero si la pregunta es cuáles son las características personales que ayudan en investigación, creo que las principales son el ser muy trabajador, constante y perfeccionista, aprovechar bien en el tiempo, que es el único recurso finito, y tratar de buscar la excelencia. También se ha de tener un punto de valentía y ambición -bien entendida- para cuestionarse todo, desde un diseño experimental hasta un dogma establecido en un campo, así como no tener miedo a salir de la zona de confort, tanto teórica como experimentalmente. Igualmente, es importante aprender a establecer y honrar colaboraciones internas y externas. Además de todo esto, yo valoro mucho el respeto hacia el tiempo y el trabajo ajeno y aprecio las actitudes empáticas y generosas, puesto que enriquecen el ambiente de trabajo y, a la larga, son muy beneficiosas para la carrera científica propia.

Mi consejo a quien empieza su carrera científica es que, en todas las etapas de su vida profesional, dedique especial atención a escoger el grupo en el que va a realizar su tesis doctoral o su periodo postdoctoral. Además de ser un grupo que haga ciencia de calidad en un campo que le apasione, creo que es importante encontrar el mentor adecuado, que le forme y ayude, y en un laboratorio en el que se sienta que puede contribuir y formar parte. Por eso es importante visitar los laboratorios que le interesen, hablar con sus futuros compañeros o con gente que ya ha estado en ese grupo. Un sitio concreto puede ser una excelente elección para unos y desastrosa para otros. Y por cierto, tampoco es un drama cambiar de laboratorio si la situación no es adecuada y no se reconduce, por las razones que sean. En resumidas cuentas, creo que una parte importante del éxito, en cualquiera de las etapas de la carrera científica, es, además del esfuerzo constante y paciente, el encontrar el ambiente adecuado en el que desarrollarse profesionalmente.

P. ¿Podría describirnos brevemente en que consiste su línea de investigación actual y cuál es su trascendencia? ¿Cómo ve el futuro de esta área científica?

R. En nuestro laboratorio utilizamos el modelo genético del ratón para estudiar cómo están estructuradas las redes de regulación génica que controlan el desarrollo en vertebrados, fundamentalmente aquellas implicadas en la morfogénesis y diferenciación del esqueleto de la extremidad. Por un lado, nos interesa mucho tratar de entender el funcionamiento del genoma regulador durante el desarrollo de la extremidad, en cómo se consiguen establecer sofisticados patrones de expresión génica, controlados temporalmente y en tipos celulares/tejidos concretos, de manera robusta. Por otro, también nos apasiona tratar de entender cómo estas mismas redes de regulación han sido alteradas durante la evolución para dar lugar a anatomías muy especializadas. Por ejemplo, utilizamos aproximaciones de genómica funcional, incluidas las de célula única, en organismos no tradicionales en biología del desarrollo, como el cerdo, en el que las extremidades son muy diferentes a las de ratón o humanas, como resultado de cambios adaptativos durante la evolución de estos animales. Finalmente, también nos interesa mucho el estudio de la especificación de subpoblaciones en el hueso durante el desarrollo, así como en estadios postnatales. Existe en el hueso compacto una gran heterogeneidad y dinámica en las poblaciones estromales mesenquimáticas, que son fundamentales para establecer el nicho hematopoyético y tienen un gran potencial biomédico por sus propiedades inmunomoduladoras. Son tiempos muy excitantes para estudiar todas estas preguntas fundamentales en Biología, puesto que la genómica funcional y las nuevas tecnologías de modificación del genoma, como CRISPR, están permitiendo conocer con mucho detalle cómo se controla la expresión génica durante el desarrollo. Esto, además de conocimiento básico, tiene implicaciones para el entendimiento de la etiología de enfermedades humanas, así como en terapias basadas en ingeniería de tejidos y reprogramación.

P. ¿Cuál es su opinión sobre cómo está articulada la carrera científica en España? ¿Qué camino queda por recorrer en Ciencia e Innovación en nuestro país?

Creo que nuestro país tiene desde hace tiempo herramientas razonablemente buenas, por ejemplo los contratos FPU, que reconocen la excelencia en los estudios y que permiten al científico en formación escoger, hasta cierto punto, el grupo donde quiere hacer su tesis doctoral. Este tipo de contratos no existen en muchos otros países, y, aunque los salarios deberían incrementarse significativamente, son una herramienta adecuada para comenzar una carrera investigadora. Pero se dan muy pocos y se quedan fuera estudiantes con expedientes realmente brillantes, así que, ¿qué tipo de mensaje se manda con esto? Algo parecido pasa con los programas Juan de la Cierva o Ramón y Cajal, herramientas buenas pero escasas. Desde hace décadas se está hablando de llegar al 2% del PIB en inversión en ciencia, la media de la UE, y no ha ocurrido. Simplemente, no se le da a la ciencia y a la innovación la suficiente importancia en nuestro país como para invertir decididamente en ella de forma sostenida, que es lo que genera transferencia de conocimiento a la industria y un tejido productivo importante. No es casualidad que las vacunas contra la COVID que han llegado al mercado vengan de Alemania, Reino Unido o EEUU. Es esta falta de inversión continuada en ciencia lo que genera gran parte de las distorsiones, temporalidad y salarios inaceptablemente bajos en la carrera científica en España. A esto se le unen algunas deficiencias estructurales del sistema, como el que la carrera investigadora esté diseñada de forma lineal, desde la etapa de estudiante predoctoral hasta llegar a ser investigador principal. No existen los mecanismos para aquellos investigadores senior que no son investigadores principales, pero con estatus científico similar y tan importantes como estos para el funcionamiento de los grupos. La falta de recursos ha hecho que, en muchos casos, estos investigadores con experiencia se hayan cansado, con razón, y abandonado sus carreras científicas, lo cual puede ser un drama personal y ciertamente una pérdida enorme para el país. Habrá que ver cuál es el impacto real de la nueva ley de la Ciencia que se está tramitando, así como de la reciente reforma laboral, para ver si realmente este tipo de situaciones se minimizan. Sin embargo, ninguna reforma tendrá impacto significativo si no se acompaña de una apuesta continuada por la inversión en ciencia y con presupuestos plurianuales que sean inmunes al vaivén político y económico.

Perfil de Javier López-Ríos Moreno

Estudió Biología en la Universidad Autónoma de Madrid (UAM). Obtuvo su doctorado (UAM, 2002) bajo la supervisión de Paola Bovolenta en el Instituto Cajal-CSIC. A continuación, realizó una etapa postdoctoral con Rolf Zeller, en la Universidad de Basilea (Suiza), investigando las funciones de la vía de señalización SHH durante el desarrollo y evolución de la extremidad de vertebrados (Nature Methods 2010; Dev Cell 2012; Dev Cell 2014, Nature 2014; Cell, 2016). Tras una etapa corta en Suiza como investigador junior independiente, en 2017 se incorporó como científico titular al Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD-CSIC/UPO/JA), en Sevilla.

Su grupo combina el sistema genético del ratón con el uso de herramientas de genómica funcional en grandes mamíferos, como el cerdo, para estudiar las redes de regulación génica que controlan la morfogénesis y evolución del esqueleto de la extremidad, así como los mecanismos de especificación de linajes celulares en el hueso (Nature 2018, Cell Reports 2020, PNAS 2021).