El desarrollo de estos estudios lo hemos dividido en tres objetivos:
El primero propone identificar los factores del hospedador implicados en la inducción de edema pulmonar (Fig. 1A). En estudios previos de nuestro laboratorio se ha mostrado que tanto el CoV del síndrome respiratorio agudo y grave (SARS-CoV) que apareció en China, como el CoV causante del síndrome respiratorio que emergió en Oriente Medio (MERS-CoV) tienen proteínas que incluyen un dominio estructural (PBM) que se une a dominios PDZ presentes en proteínas celulares. La relevancia de esta observación es que los dominios PDZ, formados por unos 80 aminoácidos, están presentes en unas 400 proteínas celulares. En total se conocen 256 motivos PDZ diferentes, y una proteína puede incluir de 1 a 13 de estos dominios, lo que les confiere la capacidad de ser un centro aglutinador de proteínas con motivos PBM, formando complejos activos. Ello hace que el virus pueda cambiar el funcionamiento de la célula en beneficio propio.
Una de las interacciones entre el motivo viral PBM de la proteína de la envuelta (E) del virus con la proteína celular sintenina que hemos identificado, ha tenido especial relevancia. Esta unión da lugar a un aumento de la fosforilación de la proteína p38 MAPK, que está implicada en la activación de la inflamación (Fig. 1B). La selección de inhibidores de la p38 MAPK dio lugar a la protección de la casi totalidad de los ratones infectados por el SARS-CoV, lo que representa la identificación de un antiviral efectivo para este coronavirus mortal humano. Los CoVs letales para el hombre inducen edema pulmonar que, en condiciones normales, se resuelve por el transporte de iones mediado fundamentalmente por tres proteínas: Na+/K+ ATPasa, el canal epitelial de iones Na+ (ENC) y el regulador de la conductancia a través de membranas de la fibrosis quística (CFTR). Estas tres moléculas contienen dominios PDZ y hemos comprobado que los virus SARS-CoV y MERS-CoV incluyen proteínas que interaccionan con estos transportadores iónicos, lo que da lugar a edema pulmonar.
Por ello estamos centrando nuestros esfuerzos en estudiar el proteoma de interacciones entre los dominios PBM del MERS-CoV y proteínas celulares que incluyen dominios PDZ. La relevancia de estos estudios radica en que hemos mostrado que el motivo PBM viral es un factor de virulencia y que las interacciones PBM-PDZ forman parte de rutas de señalización implicadas en patogénesis viral. La identificación de péptidos o compuestos químicos que interfieran con estas uniones PBM-PDZ facilitará la selección de antivirales.
El segundo objetivo propone estudiar la relevancia de los RNAs no codificantes (ncRNAs) en la inflamación inducida por los coronavirus humanos SARS- y MERS-CoV. Este estudio está dirigido fundamentalmente por Isabel Sola y se describe en la sección «Rincón del aula» de esta web.
El tercer objetivo propone el diseño de vacunas para prevenir infecciones por el MERS-CoV. En particular proponemos obtener vacunas basadas en mutantes atenuados generados mediante la deleción de genes no esenciales utilizando un cDNA infectivo que hemos ensamblado en un cromosoma artificial de bacterias (BAC). Los virus atenuados así obtenidos se están evaluando para determinar su estabilidad genética y el grado de protección que confieren frente al desafío con un virus virulento. Probablemente el candidato más interesante que hemos construido es el que se basa en un virus competente en replicación, pero defectivo en propagación, lo que le convierte en un virus que se auto elimina y por tanto debe de ser bioseguro.
La seguridad de los candidatos a vacuna que diseñamos es una de nuestras prioridades. Por ello, introducimos en las vacunas al menos tres mutaciones que atenúan el virus nativo basándose en distintos principios: reducción de su crecimiento, eliminación de su capacidad para inhibir la respuesta inmune innata, o la de optimización de codones, lo que hace a los virus menos competitivos.
La evaluación de la eficacia en protección de los candidatos a vacuna es posible porque en colaboración con otros laboratorios de EE.UU. hemos obtenido dos modelos animales de infección por SARS-CoV y el MERS-CoV. El primero utiliza ratones convencionales que son infectados por un virus adaptado a los mismos, que hemos construido incluyendo en el cDNA infectivo las mutaciones que le confieren esta propiedad. En el caso del MERS-CoV, hemos construido ratones «knock in» en los que el receptor del virus, la proteína DPP4, se ha «humanizado» mediante la reconstrucción de los tres exones que son relevantes en la interacción con el virus.
La viabilidad y éxito potencial del trabajo de nuestro laboratorio sin duda depende del diseño de un sistema de genética reversa para los CoV, y de los modelos de ratón susceptible al virus, que reproducen fielmente las patologías que estos CoVs producen en humanos.
Trabajos seleccionados del grupo:
- Almazan, F., Gonzalez, J. M., Penzes, Z., Izeta, A., Calvo, E., Plana- Duran, J., Enjuanes, L. 2000. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 97, 5516-5521.
- Almazan, F., De Diego, M.L., Sola, I., Zuniga, S., Nieto-Torres, J.L., Marquez-Jurado, S., Andres, G., Enjuanes, L. 2013. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. mBio 4, e00650-00613.
- Sola, I., Almazán, F., Zúñiga, S., Enjuanes, L., 2015. Continuous and discontinuous RNA synthesis in coronaviruses. Annu. Rev. Virol. 2 (265-288).
- De Diego, M. L., Nieto-Torres., J. L., Jimenez-Guardeño, J. M., Regla-Nava, J. A., Alvarez, E., Oliveros, J. C., Zhao, J., Fett, C., Perlman, S., and Enjuanes, L. 2011. Severe acute respiratory syndrome coronavirus envelope protein regulates stress response and inflammation. PLoS Pathog. 7, e1002315.
- Nieto-Torres, J. L., De Diego, M. L., Verdia-Baguena, C., Jimenez-Guardeno, J. M., Regla-Nava, J. A., Fernandez-Delgado, R., Castano-Rodriguez, C., Alcaraz, A., Torres, J., Aguilella, V. M., Enjuanes, L. 2014. Severe acute respiratory syndrome coronavirus envelope protein ion channel activity promotes virus fitness and pathogenesis. PLoS Pathog. 10, e1004077.
- Jimenez-Guardeno, J. M., Nieto-Torres, J. L., De Diego, M. L., Regla-Nava, J. A., Fernandez-Delgado, R., Castano-Rodriguez, C., Enjuanes, L. 2014. The PDZ-Binding Motif of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Envelope Protein Is a Determinant of Viral Pathogenesis. PLoS Pathog. 10, e1004320.
- Regla-Nava, J. A., Nieto-Torres, J. L., Jimenez-Guardeno, J. M., Fernandez-Delgado, R., Fett, C., Castano-Rodriguez, C., Perlman, S., Enjuanes, L., De Diego, M. L. 2015. SARS coronaviruses with mutations in E protein are attenuated and promising vaccine candidates. J. Virol. 89, 3870-3887.
- Jimenez-Guardeno, J.M., Regla-Nava, J.A., Castano-Rodriguez, C., Fernandez-Delgado, R., Torres, J., Enjuanes, L. 2015. Identification of the mechanisms causing reversion to virulence and in an attenuated SARS-CoV for the design of a genetically stable vaccine. Plos Pathog, 11, e1005215.