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Biofísica molecular: el estudio individualizado de máquinas proteicas

Manipular y visualizar moléculas individuales es posible actualmente gracias a un conjunto de técnicas biofísicas que permiten monitorizar la actividad de máquinas proteicas que participan, por ejemplo, en replicación, transcripción, o mantenimiento y reparación del ADN. Estas operaciones sobre el ADN son fundamentalmente mecánicas y difíciles de investigar usando metodología bioquímica tradicional.
Por Fernando Moreno Herrero Centro Nacional de Biotecnología - CSIC, Madrid fernando.moreno@cnb.csic.es
DOI: http://dx.doi.org/10.18567/sebbmdiv_ANC.2018.10.1

Hoy sabemos que muchos de los enzimas que participan en el correcto funcionamiento y mantenimiento de la célula aparecen en un número muy reducido. Por lo tanto, a esta escala celular, cada una de estas macromoléculas cuenta y si queremos comprender un proceso biológico en su totalidad necesitamos estudiar la actividad de estas proteínas de forma individualizada. Además, resulta que muchos de los procesos biológicos que involucran ADN, son fundamentalmente mecánicos donde fuerzas de tensión y torsión, generadas por la actividad celular, desempeñan un papel importante. Por ejemplo el proceso de reparación de un corte de ADN por recombinación homóloga se describe como el resultado de una serie de eventos que siguen un orden secuencial. En primer lugar se procesa el corte para generar una cadena de ADN de hebra sencilla, luego se produce el proceso de invasión en la molécula de ADN homólogo, a continuación se sintetiza nuevo ADN y finalmente se resuelve la unión Holliday que se genera. Todos esos procesos los realizan un conjunto de proteínas que deben trabajar de forma coordinada y ordenada en el tiempo. Los métodos biofísicos de molécula única permiten manipular y observar biomoléculas de una en una y estudiar cómo la fuerza afecta a estos procesos biológicos. Esta metodología permite además estudiar procesos secuenciales en una población no sincronizada. Los métodos bioquímicos tradicionales adolecen de esta aproximación de molécula única porque promedian el comportamiento del conjunto de partículas, y por tanto ese comportamiento individual que puede ser relevante para la función biológica escapa a su medida. La biofísica molecular o el estudio individualizado de máquinas proteicas se inicia en los años 80 con la invención y posterior desarrollo de la microscopía de fuerzas (AFM) y de las Pinzas Ópticas (OT).

El AFM se desarrolló como una evolución natural del microscopio de efecto túnel (STM) cuyos inventores recibieron el premio Nobel en 1986. El AFM usa la fuerza existente entre una sonda afilada y una superficie para construir la imagen de un objeto (1). Conceptualmente, el procedimiento es similar al método que usa una persona ciega para leer con sus dedos pasándolos por encima de una superficie. La posibilidad de emplear el AFM para obtener imágenes de superficies aislantes (el STM trabaja con superficies (semi)conductoras) y en medio líquido (el STM trabaja en vacío) presentó al AFM como una técnica ideal para observar y estudiar materiales biológicos incluyendo ADN y proteínas (2-4).

De forma paralela se desarrolló la otra técnica fundamental de manipulación de moléculas únicas: la Pinzas Ópticas (5). Esta técnica está basada en la fuerza generada por la presión de radiación que ejerce la luz sobre objetos dieléctricos. Al focalizar un haz láser mediante un objetivo óptico es posible atrapar microesferas de plástico y aplicar fuerzas de decenas de picoNewtons si desplazamos estas microesferas fuera de su posición de equilibrio. Esta técnica permitió al grupo de Block a principios de los 90 medir el movimiento de la kinesina sobre los microtúbulos (6) y determinar que se mueve dando pasos de 8 nm (7). El uso de microesferas de plástico para manipular material biológico derivó en los primeros experimentos mecánicos sobre el ADN usando partículas magnéticas realizado por el grupo de Bustamante (8) y en la invención de las Pinzas Magnéticas por parte del grupo de Bensimon y Croquette tal y como las conocemos hoy en día (9). Ambos grupos consiguieron medir la respuesta mecánica del ADN abriendo la puerta a estudiar motores moleculares que modifican la estructura del ADN: polimerasas, helicasas, topoisomerasas, enzimas de restricción, etc. (9-11). El término Pinzas Magnéticas se acuñó en analogía con su predecesor, las pinzas ópticas. Sin embargo las pinzas magnéticas, en realidad tiran de las microesferas mediante imanes en lugar de atraparlas. Esta peculiaridad supone una diferencia fundamental y es que es posible aplicar fuerzas a múltiples moléculas de ADN simultáneamente incrementando la eficiencia de las medidas, y también aplicar un torque sobre el ADN simplemente girando los imanes. Estas características convierten a las pinzas magnéticas en un instrumento extraordinariamente versátil para estudiar actividades enzimáticas dependientes de fuerza y torsión.

Durante los últimos años, estos instrumentos se han desarrollado enormemente consiguiendo mayor resolución y su combinación con otras técnicas como la microscopía de fluorescencia. Estos equipos combinados han permitido realizar experimentos muy complejos con resolución por debajo del nanómetro y fuerzas con precisión sub-pN. Nuevas tecnologías como la microscopía de super-resolución, las técnicas de secuenciación por fluorescencia, o el desarrollo de nanoporos biológicos o de estado sólido para secuenciación, no hubieran sido posibles sin el conocimiento previo que todo el desarrollo de técnicas de molécula única ha proporcionado. El papel que grupos de (bio)físicos e ingenieros han jugado en el desarrollo de estas tecnologías ha sido fundamental y esto ha facilitado que hoy en día estén accesibles a muchos investigadores que trabajan en biomedicina y biotecnología.

La figura representa un experimento de pinzas magnéticas donde un campo magnético (líneas paralelas) ejerce una fuerza sobre una microesfera magnética a la que se une una molécula de ADN. La proteína es una helicasa que abre la doble hebra del ADN y como consecuencia modifica la extensión de la molécula.
Referencias:
  1. Binnig, G., C. F. Quate, and C. Gerber. 1986. Atomic force microscope. Phys. Rev. Lett. 56:930-933.
  2. Hansma, H. G., J. Vesenka, C. Siegerist, G. Kelderman, H. Morrett, R. L. Sinsheimer, V. Elings, C. Bustamante, and P. K. Hansma. 1992. Reproducible imaging and dissection of plasmid DNA under liquid with the atomic force microscope. Science 256:1180-1184.
  3. Moreno-Herrero, F., M. de Jager, N. H. Dekker, R. Kanaar, C. Wyman, and C. Dekker. 2005. Mesoscale conformational changes in the DNA-repair complex Rad50/Mre11/Nbs1 upon binding DNA. Nature 437:440-443.
  4. Yeeles, J. T., K. van Aelst, M. S. Dillingham, and F. Moreno-Herrero. 2011. Recombination hotspots and single-stranded DNA binding proteins couple DNA translocation to DNA unwinding by the AddAB helicase-nuclease. Molecular Cell 42:806-816.
  5. Ashkin, A., and J. M. Dziedzic. 1987. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria. Science 235:1517-1520.
  6. Block, S. M., L. S. Goldstein, and B. J. Schnapp. 1990. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature 348:348-352.
  7. Svoboda, K., C. F. Schmidt, B. J. Schnapp, and S. M. Block. 1993. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature 365:721-727.
  8. Smith, S. B., L. Finzi, and C. Bustamante. 1992. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science 258:1122-1126.
  9. Strick, T. R., J. F. Allemand, D. Bensimon, A. Bensimon, and V. Croquette. 1996. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science 271:1835-1837.
  10. Smith, S. B., Y. Cui, and C. Bustamante. 1996. Overstretching B-DNA: the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science 271:795-799.
  11. Carrasco, C., N. S. Gilhooly, M. S. Dillingham, and F. Moreno-Herrero. 2013. On the mechanism of recombination hotspot scanning during double-stranded DNA break resection. Proc Natl Acad Sci USA 110:E2562-2571
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Entrevista a Fernando Moreno Herrero

P.- ¿Cuándo surgió su vocación científica? 

R.- Es difícil poner fecha a un momento así. En mi casa siempre hemos convivido con la ciencia, con los papers y referees y con los congresos y las clases. Mis padres, ambos biólogos moleculares en la Universidad de Oviedo han dirigido su grupo de investigación durante muchos años y para mí era frecuente volver del colegio y pasar por su laboratorio y jugar con el vórtex o algún otro aparatito interesante que hacía algo. Me encantaba cacharrear y construir cosas y supongo que el coctel científico-tecnológico resultó en que estudiara ciencias físicas y me especializara en su aplicación para entender cómo funciona la biología. Mi afición constructora no ha decaído en ningún momento pues en el grupo construimos y desarrollamos nuestra propios equipos científicos para investigar interacciones ADN-proteína de una en una. Así que seguramente la vocación siempre estuvo ahí, escrita en los genes, y alimentada por el contacto directo con la ciencia.

P.- ¿Podría resumirnos brevemente su trayectoria profesional?

R.- Motivado por ese afán de entender cómo funcionan las cosas estudié ciencias físicas en la Universidad de Oviedo. Esta formación me proporcionó una base matemática importante pero también una forma de pensar flexible para afrontar problemas científicos de cualquier tipo y buscar soluciones. Fue en los últimos años de la carrera cuando fascinado por la complejidad de la biología decido orientar mis esfuerzos hacia esta área y al licenciarme me traslado a Madrid, a la Universidad Autónoma de Madrid, para realizar un doctorado en Biofísica con el fin de estudiar problemas biológicos con el Microscopio de Fuerzas Atómicas (AFM). Me integré en el grupo del Prof. Arturo Baró, un grupo de físicos constructores de AFMs, donde Arturo tenía un gran interés por la biología. La mezcla fue perfecta pues yo me encontraba a gusto rodeado de cables y aparatos en un grupo donde se construían aparatos, pero también con toda la libertad para desarrollar una línea de investigación nueva usando el AFM para ver interacciones ADN-proteína, estudiar las propiedades físicas del ADN, o investigar agregados o polímeros de proteínas. El uso del AFM en biología era anecdótico en España en aquella época y muy reducido a nivel internacional. La apuesta fue arriesgada pero salió muy bien, porque fruto de las numerosas colaboraciones con biólogos que impulsé publicamos bastantes artículos. Mi tesis doctoral fue pionera en España en el uso del AFM y su aplicación a la biología. Las buenas publicaciones me permitieron realizar una estancia postdoctoral de tres años en la Universidad Técnica de Delft, bajo la supervisión del Prof. Cees Dekker. Una persona fascinante y también físico reconvertido a biofísico. De nuevo tuve la suerte de trabajar en un grupo extraordinario tanto personal como profesional donde se construían aparatos únicos y de esta forma se investigaban problemas biológicos de una forma no convencional. Esto proporcionaba una ventaja competitiva fundamental para ir por delante de otros laboratorios que usaban equipos comerciales. Mi etapa postdoctoral en Holanda fue fantástica y mis trabajos me abrieron la puerta a conseguir un contrato Ramón y Cajal en el Institut Catalá de Nanotecnologia y un proyecto Starting del ERC. Toda esta trayectoria me permitió conseguir una posición permanente en el CSIC, en el Centro Nacional de Biotecnología, donde dirijo el grupo de Biofísica Molecular desde 2009 financiado fundamentalmente con dinero europeo.

P.- ¿La repetiría en su totalidad? 

R.- Sin duda. Me considero una persona muy afortunada por haber estado en contacto con gente muy interesante. Siempre he intentado sacar el máximo de cualquier situación y oportunidad. He tenido la visión y la suerte de buscar temas científicos interesantes y de tener compañeros de trabajo extraordinarios que me han ayudado a crecer como persona y como científico. Ahora como investigador principal intento inculcar en los miembros de mi equipo ese mismo espíritu colaborador pero con altitud de miras y objetivos ambiciosos. Creo que una de las misiones como mentor es intentar motivar a mis estudiantes para que den lo mejor y lo máximo.

P.- ¿Cuáles son desde su punto de vista las características que definen a un buen investigador?

R.- Para mí hay dos características que son fundamentales: la honestidad y la generosidad. En primer lugar el investigador tiene que ser honesto consigo mismo pero también con la sociedad que es al final quien financia. No hay fórmulas mágicas y sí mucho trabajo y perseverancia en una idea, un objetivo o una intuición. En esta profesión hay que trabajar duro y si se hace así, las cosas tarde o temprano salen bien. Yo soy de los que pienso que el tiempo pone a cada uno en su sitio. El investigador debe ser generoso también, porque, ¿qué es lo realmente importante? Que la ciencia progrese y eso se consigue con el esfuerzo colectivo de muchos. Hay que colaborar y hay que ayudar desde las posiciones de poder a aquellos que lo merecen. Premiando el mérito y el trabajo. La investigación científica ha cambiado mucho desde que yo empecé mi carrera. Se ha vuelto tremendamente competitiva y cada vez más las métricas se imponen en cualquier proceso de selección. Yo todavía creo en la motivación por descubrir y avanzar en la ciencia sin pensar en la tiranía de las métricas.

P.- ¿Qué consejo daría a los que ahora inician su carrera científica?

R.- Este es un trabajo vocacional y no es un trabajo estándar donde se cumplen unas horas, te vas a casa y desconectas. No ganarás grandes cantidades de dinero pero a cambio tendrás la oportunidad de sentir la enorme satisfacción de publicar un artículo en una revista científica importante después de años de trabajo y aportar tu granito de arena a la ciencia. Sin duda mi consejo para aquellos que inician su carrera científica es que disfruten con su trabajo en un laboratorio, que se planteen objetivos ambiciosos y tengan amplitud y altura de miras. Es importante plantearse preguntas relevantes y escoger un buen grupo científico en una institución relevante que tenga la posibilidad de responderlas. Es importante hablar y comunicar los resultados y trabajar desde el minuto cero en la red científica con la que te moverás en el futuro. Hay que trabajar mucho, ser honesto, humilde pero a la vez buscar grandes retos y objetivos.

P.- ¿Podría describirnos brevemente en qué consiste su línea de investigación actual y cuál es su trascendencia?

R.- Estamos interesados en entender procesos biológicos de reparación, replicación, y organización del ADN desde un punto de vista biofísico usando novedosas técnicas de manipulación y observación de moléculas individuales. También nos interesan las propiedades mecánicas de los ácidos nucleicos y su papel en la actividad de proteínas que interaccionan con ellos.
Durante los últimos años hemos construido una serie de equipos que nos permiten estudiar interacciones ADN-proteína y la mecánica de ácidos nucleicos a nivel molecular. Disponemos de Microscopios de Fuerzas Atómicas, Pinzas Magnéticas de alta resolución y sistemas combinados de Pinzas Magnéticas y microscopía TIRF que permiten visualizar complejos ADN-proteína e inferir la actividad biológica de máquinas proteicas a partir de cambios en la extensión del ADN. Recientemente hemos combinado nuestros equipos con fluorescencia, lo cual nos permite además correlacionar actividad biológica con la presencia de una proteína o complejo proteico.
Algunos de los resultados del grupo incluyen la descripción del proceso de resección de ADN para su reparación por recombinación homóloga en bacterias por la proteína AddAB, el descubrimiento de la función de condensación de ParB, el papel de algunas proteínas de inicio de la replicación, o la estructura del segrosoma en sistemas de partición de tipo III. Toda la información del grupo de investigación se puede encontrar en www.fernandomorenoherrero.com.

P.- ¿Qué camino queda por recorrer en Ciencia e Innovación en nuestro país?

R.- En realidad la pregunta es si el camino que se recorre va en la buena dirección. El camino se puede recorrer más o menos rápido pero lo importante es que lo que se ande sea en la dirección correcta. Y hay muchas cosas que indican que la dirección no es buena. Me gustaría comentar sobre uno de los asuntos que genera más incertidumbre a los investigadores que es la falta de un calendario fiable en las convocatorias nacionales. La mayoría de las solicitudes o toma de decisiones, a cualquier nivel profesional, predoctorales, postdoctorales, investigadores principales, se realiza con mucho tiempo de antelación (6-12 meses), entre otras cosas porque generalmente el correspondiente proceso de evaluación y selección lo exige. Esto obliga a una planificación detallada a más de un año vista. La ausencia de un calendario fiable y cíclico, con fechas de solicitud, evaluación, e inicio de proyectos tiene unas consecuencias nefastas. Como no se sabe cuándo saldrá tu convocatoria, muchos de tus proyectos o ideas están parados o en suspenso. Como el estudiante que quiere hacer la tesis contigo no sabe cuándo saldrá la convocatoria de becas predoctorales, decide que se va a otro laboratorio extranjero donde sí le aseguran una fecha de inicio, o decide después de 6 meses que ya no puede esperar más. De igual forma, como el investigador principal no sabe cuándo saldrá la convocatoria de becas predoctorales asociadas a su proyecto, no puede ofertar posiciones predoctorales en su grupo. Como no se sabe el día en que un proyecto de investigación pre-concedido es funcionalmente activo, el investigador principal pospone contrataciones, la compra de equipamiento, etc., con el consiguiente perjuicio al proyecto científico para el cual el dinero había sido concedido; además de la desestabilización de otros proyectos internacionales que se ven afectados por el proyecto nacional. Todo este caos regulatorio contrasta con convocatorias de instituciones internacionales: European Research Council, Human Frontiers Science Program, Wellcome Trust, etc., donde conseguir financiación es muy difícil pero las reglas están claras. Se sabe que todos los años la convocatoria sale en una fecha determinada y que si sacas uno de estos proyectos, el proyecto comenzará tal fecha y los fondos estarán disponibles para entonces. Lamentablemente, estas incertidumbres están calando en los más jóvenes, la base del sistema, que ya ni siquiera muestran interés por hacer la tesis doctoral. En definitiva no sólo es que la ciencia española esté infra-financiada, sino que la gestión de los recursos es muy ineficiente debido entre otras cosas a la falta de predictibilidad de las convocatorias. Y esto es responsabilidad directa de nuestros dirigentes.

Perfil de Fernando Moreno Herrero

Fernando Moreno Herrero es Investigador Científico del CSIC en el Centro Nacional de Biotecnología (Madrid), licenciado en Ciencias Físicas por la Universidad de Oviedo (1998) y Doctor en Ciencias por la Universidad Autónoma de Madrid (2003). Su investigación se centra en el estudio de procesos de reparación, replicación y organización del ADN mediante técnicas biofísicas de molécula única. Sus trabajos han permitido dilucidar el mecanismo de resección del ADN por AddAB para su reparación por recombinación homóloga en bacterias (Mol. Cell, PNAS, NAR). Sus desarrollos de nuevos métodos en pinzas magnéticas han permitido descubrir nuevas funciones en proteínas o propiedades físicas de ácidos nucleicos (Small, NAR, PNAS, eLife). Autor de más de 65 publicaciones, e investigador principal de varios proyectos ERC (Starting 2007, PoC 2014, y Consolidator 2015), el Dr. Moreno-Herrero ha recibido diversos premios que demuestran el impacto de su investigación (UAM, SEBBM, SBE, y “Miguel Catalán” de la CAM).