La microbiota intestinal es el conjunto de microorganismos (bacterias, virus y hongos, entre otros) que residen en el delicado equilibrio del tracto gastrointestinal, desempeñando un papel esencial en la salud y el funcionamiento óptimo del organismo. Estos microorganismos desempeñan funciones imprescindibles para el correcto funcionamiento del cuerpo humano: contribuyen a la descomposición de alimentos durante la digestión, producen metabolitos beneficiosos y refuerzan el sistema inmunitario. La composición de la microbiota intestinal, y por tanto las funciones que ejerce esta comunidad, está influenciada por una variedad de factores como la dieta, el estilo de vida y la genética, y se asocia también a la salud humana: se han descubierto asociaciones con enfermedades metabólicas, autoinmunes y neurodegenerativas, aunque en la mayoría de casos se desconoce si la microbiota es causa o consecuencia de las mismas. Para tratar de entender mejor cuál es el papel de la microbiota en estas enfermedades, en la última década, numerosos estudios han combinado estudios de la composición de la microbiota con estudios en los que se evalúan directamente las funciones de la misma, usando herramientas como la metatranscriptómica.
La metatranscriptómica trata del estudio del transcriptoma de todos los microorganismos presentes en un nicho biológico específico. El transcriptoma consiste en el conjunto de los ARNs expresados por parte de cada uno de estos microorganismos, con lo que la metatranscriptómica es una representación de las funciones que realizan los microorganismos de una comunidad. En el caso de la microbiota intestinal, la metatranscriptómica puede indicar las funciones que ejerce esta comunidad en distintas condiciones, como por ejemplo en distintas enfermedades. Por tanto, los estudios de metatranscriptómica no se limitan a la mera identificación de los microorganismos presentes en un ecosistema, sino que buscan comprender cómo estos microorganismos funcionan y se comunican dentro de su entorno biológico. Esta técnica es, por tanto, esencial para identificar aquellas funciones que podrían influir en la salud humana, así como los microorganismos que las realizan.
El presente: la metatranscriptómica aplicada a la microbiota intestinal
En el contexto de la microbiota intestinal, esta técnica se ha venido llevando a cabo durante la última década, principalmente en muestras fecales, ya que son fáciles de obtener sin procedimientos invasivos y presentan una gran biomasa microbiana, facilitando la obtención de grandes cantidades de ARN bacteriano (Figura 1). Por ejemplo, en humanos se ha empleado esta técnica para evaluar el ecosistema microbiano en diferentes enfermedades intestinales inflamatorias como la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa (Lloyd-Price et al., 2019 Nature). Sin embargo, pese a las ventajas de las muestras fecales en cuanto a su facilidad de obtención y su abundante carga microbiana, éstas presentan también algunos inconvenientes. En primer lugar, la vida media del ARN bacteriano se encuentra en torno a los 5-10 minutos. De esta forma, es importante incluir procedimientos específicos para preservar el ARN correctamente desde el momento en que se recoge la muestra. Además, aunque la metatranscriptómica en muestras fecales puede ser una técnica idónea para estudiar interacciones entre los miembros de la microbiota intestinal, para el estudio de enfermedades que cursan con alteraciones específicas en el intestino, estas muestras pueden no ser suficientemente representativas. Por ejemplo, en el estudio del papel de la microbiota en el desarrollo del cáncer de colon, las muestras fecales posiblemente hayan estado en contacto directo con el tumor horas antes de su obtención. De esta forma, si la vida media del ARN en bacterias es del orden de unos pocos minutos, el ARN en estas muestras fecales puede no ser representativo de las funciones que estos microorganimos desempeñan en contacto directo con el tumor.
Como alternativa al uso de muestras fecales en estos estudios, se encontraría el uso de biopsias intestinales, en las que es posible muestrear el ARN de la microbiota intestinal directamente en contacto con el hospedador (Granata et al., 2020 Microorganisms) en diferentes condiciones: en tejido sano, tumores, áreas inflamadas en Enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, etc. (Figura 1). Sin embargo, la obtención invasiva de estas muestras, mediante procedimientos endoscópicos, dificulta mucho el acceso a estas muestras. Además, la obtención de biopsias mediante colonoscopia suele implicar un procedimiento previo de limpieza de colon, para eliminar el exceso de contenido y permitir una correcta visualización del intestino. Esto hace que en las biopsias obtenidas, la biomasa microbiana sea muy baja en comparación con las muestras fecales. De esta forma, al secuenciar el transcriptoma de estas muestras, la mayoría del ARN que se obtiene pertenecerá al hospedador, y solo un pequeño porcentaje a la microbiota, lo que encarece mucho esta técnica. A pesar de estas dificultades, existen algunos estudios que han llevado a cabo metatranscriptómica en biopsias intestinales en humanos. Por ejemplo, para estudiar si la microbiota intestinal está relacionada con el desarrollo de la obesidad u otras enfermedades metabólicas.
En modelos animales también se han realizado estudios de metatranscriptómica en muestras intestinales. En ratones, una estrategia muy utilizada es tomar muestras del contenido del ciego, con elevada carga bacteriana, para el análisis metatranscriptómico. Esta alta carga microbiana facilita en gran medida la obtención de resultados tanto metagenómicos como metatranscriptómicos. Sin embargo, y como ocurre en humanos, todavía no hay apenas estudios que empleen biopsias intestinales para este tipo de análisis.
Si bien el número de estudios metatranscriptómicos en biopsias intestinales son escasos, sí hay un mayor número de este tipo de estudios en otros nichos del cuerpo, destacando aquellos que exploran la relación entre las funciones de la microbiota del tracto respiratorio y enfermedades pulmonares. En su mayoría, estos estudios se han realizado con muestras clínicas para estudiar el papel de la microbiota en infecciones respiratorias. Las ventajas de esta técnica son varias: en primer lugar, muestras de la microbiota en contacto directo con el hospedador son relativamente más sencillas de conseguir: hisopos, esputos o lavados broncoalveolares son algunos ejemplos de muestras usadas. Finalmente, estos trabajos demuestran que la metatranscriptómica en este tipo de muestras permite estudiar tanto el papel de la microbiota como la respuesta del hospedador en procesos infecciosos, ya que también se consiguen aislar células del hospedador en estas muestras.
Retos actuales de la metatranscriptómica en tejidos intestinales
Dado el escaso número de estudios disponibles a día de hoy, se deben abordar todavía muchos retos pendientes para una adopción más generalizada de técnicas de metatranscriptómica aplicadas a biopsias gastrointestinales. Uno de los mayores retos, más allá de la obtención de muestras, es el procesado de las mismas. Como se ha mencionado anteriormente, estas muestras contienen una gran cantidad de ARN del hospedador y muy poca carga microbiana. Esto encarece el precio de la secuenciación y además supone un gran riesgo de contaminación de las muestras con ARN ambiental, del operador o presente en los kits de extracción de material genético. Algunos estudios en la última década han intentado abordar estos problemas, por ejemplo, tratando de enriquecer el ARN bacteriano en muestras complejas. Otros estudios han propuesto el uso de tipos de muestra alternativos a las biopsias, como las obtenidas usando cepillos de citología, que contendrían un mayor porcentaje de ARN microbiano y dañarían menos el tejido original. En cuanto a la contaminación en estas muestras, ha sido estudiada sobre todo en el contexto de análisis de secuenciación de amplicones 16S, pero los estudios sobre el impacto de estos posibles contaminantes en metatranscriptómica son todavía escasos.
Otro de los retos al que debemos dar respuesta para poder generalizar los estudios de metatranscriptómica en tejidos tiene relación con el análisis de datos. Hoy en día existen muchas herramientas con las que analizar datos de metatranscriptómica, aunque en el caso de la microbiota intestinal, se han evaluado mayormente en datos de muestras fecales. En el caso de muestras con baja carga microbiana y un elevado porcentaje de ARN del hospedador, muchas de estas herramientas no han sido evaluadas. Solo recientemente, un estudio ha realizado un análisis comparativo de diferentes herramientas en este tipo de muestras, usando datos experimentales en los que se mezcla ARN de humano y de comunidades definidas de bacterias en diferentes proporciones, simulando así diferentes tipos de muestras de tejidos y sugiriendo los métodos más adecuados para cada tipo de muestra. Sin embargo, las comunidades usadas tienen una complejidad reducida en comparación con la microbiota intestinal, de forma que son necesarios más estudios con muestras reales (o, al menos, de mayor complejidad) para poder establecer unos estándares de análisis en el campo.
En cuanto al análisis de datos metatranscriptómicos, también se han llevado a cabo estudios en los que se reanalizan datos de secuenciación de ARN de biopsias de distintos tejidos, provenientes de estudios previos, por ejemplo, en el contexto del cáncer. Estos estudios previos tenían como objetivo estudiar el transcriptoma del hospedador, de forma que la metodología experimental no era idónea para la detección de bacterias. Aún así, usando diferentes métodos bioinformáticos se han podido recuperar datos de bacterias. Estos métodos serían potencialmente aplicables a biopsias intestinales, dado que han sido desarrollados para muestras con muy baja carga microbiana. Sin embargo, han sido objeto de numerosas críticas, ya que no emplean estrategias adecuadas para eliminar contaminantes o para el posterior análisis de los datos de bacterias obtenidos (Gihawi et al., 2023 mBio).
El futuro: de la metatranscriptómica actual a los estudios en célula única y transcriptómica espacial para comprender mejor las interacciones entre microorganismos y hospedador
Además de los retos actuales de la metatranscriptómica, nuevas tecnologías desarrolladas en los últimos años tienen el potencial de aplicarse para un estudio mucho más exhaustivo y detallado de las funciones de las bacterias intestinales. Entre ellas, destacan las tecnologías de secuenciación de ARN single-cell (scRNA-seq), que aplicadas a distintos tejidos y muestras permiten estudiar la expresión de genes en células individuales. Por el momento, estas técnicas se aplican a tejidos del hospedador, cuyas células tienen cantidades de ARN mayores que las bacterias y presentan otras ventajas, como la ausencia de pared celular que permite acceder al ARN con mayor facilidad. A pesar de ello, en distintos estudios recientes se han realizado análisis similares a los detallados anteriormente, en los que se intentan encontrar bacterias y otros microorganismos a partir del reanálisis de datos de scRNA-seq (Figura 2). Algunos de estos estudios, realizados a gran escala estudiando datos de scRNA-seq de múltiples tejidos y órganos (Mahmoudabadi et al., 2022 biorXiv), adolecen de la misma problemática que los estudios que reanalizan datos públicos de secuenciación de ARN: se emplean herramientas bioinformáticas creadas específicamente para tal fin, sin estar validadas en datos externos, y en numerosas ocasiones no presentan filtros adecuados para evitar la detección de contaminantes. Otros estudios, realizados a menor escala, han tomado medidas más estrictas para evitar la detección de contaminantes en este tipo de análisis. Por ejemplo, un reanálisis de datos de scRNA-seq obtenidos a partir de pacientes COVID-19 pudo identificar patógenos oportunistas que fueron detectados también por otras técnicas, como el cultivo de estos patógenos.
Estos estudios que detectan la presencia de diferentes microorganismos en datos de scRNA-seq presentan diferentes ventajas. En primer lugar, es posible identificar si estos microorganismos se asocian a un tipo celular concreto. Esta “asociación” puede significar que se anclen a la membrana celular o que sean internalizados, por ejemplo, por células del sistema inmunitario que los fagocitan. Además, es posible estudiar la respuesta específica de las células asociadas a bacterias, respondiendo a algunas de las siguientes preguntas ¿expresan rutas metabólicas diferentes? ¿expresan señales de estrés o inflamación? Aplicado a tejidos intestinales, se podría obtener una gran información de qué miembros de la microbiota interactúan directamente con diferentes células del epitelio intestinal, y cómo se produce dicha interacción.
A pesar de estas ventajas, el mayor inconveniente de estos estudios es la escasa resolución que muestran en cuanto a los microorganismos detectados. La tasa de detección es muy baja, ya que la metodología experimental que conllevan no es óptima para la detección de bacterias y otros microorganismos. Esto hace que pueda haber sesgos, en los que algunos miembros de la microbiota estén sobrerepresentados y otros no se puedan detectar. Además, los datos obtenidos en estos microorganismos son tan escasos que no permiten estudiar qué genes expresan estos miembros de la microbiota, y estos métodos actualmente sólo se limitan a la detección de los mismos.
De forma similar, y más recientemente, estudios de transcriptómica espacial han permitido revelar la expresión de genes en células de diferentes tejidos, correlacionándola con la localización específica dentro de una muestra (Figura 2). Estos estudios han sido de especial relevancia en el estudio de tumores, donde hay una gran heterogeneidad en la expresión de genes. Recientemente, se han empezado a combinar estos estudios con la detección in situ de bacterias, mediante microscopía o técnicas moleculares (Galeano-Niño et al., 2022 Nature). Esto permite asociar la presencia de bacterias a diferentes patrones de expresión en el tejido del hospedador. Sin embargo, al igual que en el caso de los estudios de scRNA-seq, todavía no es posible detectar la expresión de genes en estos microorganismos.
Durante los últimos años, se han desarrollado tecnologías de scRNA-seq y transcriptómica espacial específicas para bacterias, en las que es posible identificar la expresión de genes en bacterias individuales. Por el momento, su aplicación se restringe sobre todo a bacterias modelo muy estudiadas (Escherichia coli o Bacillus subtilis entre otros). Es probable que en los próximos años se continúen desarrollando estos métodos para su aplicación a muestras complejas, como la microbiota intestinal, y que se desarrollen nuevos métodos que permitan analizar a la vez la expresión de genes en células del hospedador y bacterias individuales (Lloréns-Rico et al., 2022 Cell).
En definitiva, la microbiota intestinal desempeña un papel crucial en la salud y el bienestar humano, a través de las funciones que realiza. Para el estudio de estas funciones, la metatránscriptómica permite identificar qué genes expresa cada uno de los miembros de este ecosistema complejo. A pesar del uso de esta técnica relativamente extendido en muestras fecales, se necesitan nuevas estrategias para poder generalizar su uso a tejidos intestinales, y aumentar la resolución en los análisis mediante técnicas de célula única. Sólo así se podrá entender mejor la expresión de estas comunidades directamente en su nicho ecológico, lo que permitirá una mejor comprensión de cómo la microbiota contribuye a nuestra salud o su papel en distintas enfermedades.
Para leer más
- Granata, Ilaria et al. “Duodenal Metatranscriptomics to Define Human and Microbial Functional Alterations Associated with Severe Obesity: A Pilot Study.” Microorganisms vol. 8,11 (2020): 1811
- Gihawi, Abraham et al. “Major data analysis errors invalidate cancer microbiome findings.” mBio vol. 14,5 (2023): e0160723.
- Mahmoudabadi, Gita et al. “Single Cell Transcriptomics Reveals the Hidden Microbiomes of Human Tissues” bioRxiv (2022): 10.11.511790
- Galeano Niño, Jorge Luis et al. “Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer.” Nature vol. 611,7937 (2022): 810-17
- Lloréns-Rico, Verónica et al. “Single-cell approaches in human microbiome research.” Cell vol. 185,15 (2022): 2725-38
- Lloyd-Price, Jason et al. “Multi-omics of the gut microbial ecosystem in inflammatory bowel diseases.” Nature vol. 569,7758 (2019): 655-62.
